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山水88木虫 (正式写手)
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T7启动子表达请教已有3人参与
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我做的是染色体整合，将pET载体上的基因连同T7启动子和终止子（启动子后有lac）一起整合入DE3化的菌株，菌株是自己用试剂盒DE3化的，结果我要的目的产物产量有了提高，但是提高量不是很多，而且整合后的菌株不加IPTG诱导剂才会有所提高，而加了IPTG(1 mM)后的产量几乎与原菌株无差别。跑SDS-PAGE图两者都没有明显蛋白表达量增多。那么请问出现这种现象是为什么呢？按理说应该是添加IPTG后才会表达更多吧，那么如果这样是不是可以认为我现在的提高是一种基底表达，而真正的表达条件我可能还没有摸索清楚，所以产量反倒因为IPTG的毒性而不会提高呢？ 非常感谢大家的应助！ |
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1.整合后，我要的目的产物产量有了提高，但是提高量不是很多 提高量不是很多怎么理解，跟谁进行比较，跟内源的没整合pET载体的菌株进行比较，还是跟仅是转化pET的菌株比较？该菌株基因组上是否含有你的目的基因？ 2. 而且整合后的菌株不加IPTG诱导剂才会有所提高，而加了IPTG(1 mM)后的产量几乎与原菌株无差别。 如果假设你的菌株DE3化和pET载体整合都没有问题的话，不加IPTG诱导剂是不会有你外源基因的表达的(表达leak除外)，而你在不加IPTG诱导剂才会有所提高，你是不是要看下，在非诱导条件下是不是T7 RNA polymerase 不受控制的表达。还有一种情况，就是IPTG诱导后，你转的那个基因根本没有表达，就像你所说，你检测到的蛋白始终是宿主内源的蛋白(假设宿主也表达该蛋白) 3. 按理说应该是添加IPTG后才会表达更多吧，那么如果这样是不是可以认为我现在的提高是一种基底表达 你可以用His的抗体，做个wb看一下是否有外源基因的表达 |
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山水88
2楼2014-05-29 14:32:25
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1. 那么我怎么验证非诱导条件下T7 RNA聚合酶是否表达呢？ 有一个方法就是用T7 RNA聚合酶的抗体来杂，不知道你们是否有条件做这个实验 2. IPTG诱导后基因没有表达这个可能性很大，因为我用质粒表达的话蛋白量也没有明显增加。 你在做整合之前，应该先搞清楚你的蛋白是否会表达，以及表达量怎么样，既然你用质粒表达，蛋白量也没有明显增加，那可能是载体表达的问题，跟你整合无关，建议尝试换其他的载体来测试你基因的表达，筛选到合适的表达载体后，再将载体整合进宿主。 3. 根据目前的情况，您觉得我应该再做哪些实验进行验证呢。 可以用His的抗体做WB，来检测你蛋白是否表达，但即使用WB检测到有表达，也没有意义，离你要求肉眼可见的表达差异还差很远 |
5楼2014-05-29 16:43:42
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LZ的基因本来就存在于E.coli基因组中，但是属于低水平的表达, LZ的实验首先是构建了重组pET后转化DE3的E.coli然后诱导发现表达量不高，之后试图通过整合基因组的方法提高拷贝数来增加基因的表达量对吧？ 如果是这个流程我有几点疑问。 1.你首先得分析下含有重组质粒的E.coli表达量不高的原因。是你用的这个宿主菌本身重组质粒的拷贝数就不高？还是后期诱导表达条件的问题？还是你对宿主菌的DE3处理不成功？你先前的对照怎么做的，拿重组质粒转化子和空载转化子用等量的IPTG诱导一次对比一下。如果表达量低首先考虑诱导条件的问题，LZ上面给出的诱导温度太高了。超过30度诱导效果会逐渐下降，按你的温度来看诱导效果非常差，诱导的蛋白甚至可能都是包涵体，我都是用25—28度诱导的，菌体OD0.6差不多，到0.8也行，IPTG 0.5mM就足够了，我一般用0.25mM，你菌体本身OD就不高，加的IPTG又多自然对细胞的负荷就大。还有你用的摇瓶还是试管诱导的？体系的溶氧量对诱导影响也很大。当你把所有的优化做完表达量还是上不去，排除了包涵体、载体本身和对宿主菌的DE3处理是否成功的问题后，那只可能是你的载体和你用的宿主菌不兼容，拷贝数很低，无法通过重组质粒诱导，所以你才做基因组整合。 2.你重组后不诱导蛋白量有提高，诱导后就没变化了。你确定不诱导前表达量提高是因为基因整合而产生效果而不是因为菌体OD不同而导致的误差？你用IPTG没有效果是不是你对菌株的DE3处理不成功？如果DE3是成功的话那你的基因前面确实带着T7启动子吗，启动子完整不完整？或者还是诱导条件的问题？或者你整合的拷贝数也不高？你现在的问题是你整合的基因到底诱导表达了没有，最好是做个杂交验证下。 3.你的菌在IPTG诱导的时候不长还是你IPTG浓度的问题，如果是溶原噬菌体污染应该是菌体OD值正常升高到一定程度后突然OD值又开始迅速下降到一个很低的状态，而不可能一致维持在某个浓度下不动。再说你用于DE3处理的噬菌体都是把触发裂解步骤的序列全部敲除掉后的灭活噬菌体，很安全的。 |
9楼2014-06-02 04:31:38
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1.我的终目的是通过增加关键酶量来提高产物的产量，目前都用的是20/250mL摇瓶发酵。质粒和宿主是没问题的，前期做过表达，可能有表达不稳定，但是有成功过，能够提高我的终产物产量。只是近期可能质粒表达条件不当而没有了以前的明显表达。正是鉴于它的不稳定以及质粒不利于工业化我才选择了染色体整合。诱导温度我现在又试了20度30度，IPTG也试了0.5mM，结果也是同样不加IPTG我的终产物产量有了明显提高，而其它条件和我用的37度、1mM IPTG差别不是很大，只是菌液的OD能够进一步提高。 2.试用了20和30度之后OD差别不是很大了，但是整合前后对比提高仍然很明显，甚至比目前的质粒表达效果还好一些。DE3化目前验证结果是成功的，我也就没有继续再验证了。T7启动子是质粒载体上标有T7 promoter那一段，整合之后都是经过了测序验证的，只是最近发现少了T7前面的lacI序列，但是这个影响应该不是很大的吧，DE3化也会整合入lacI序列，最多只是把我的诱导表达变成组成型表达。整合之后基因的拷贝数也只是增加了一个，仅稳定性提高，所以跑SDS-PAGE看不出来蛋白明显表达也是应该的吧。 3.现在温度降价IPTG浓度降低菌株可以继续生长了，这个条件确实对影响挺大的，但现在就是这样我的终产物还是不加IPTG的要高。 非常感谢您的回复！ |
10楼2014-06-02 15:04:56
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