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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请教做过基因染色体整合的大侠们
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山水88

木虫 (正式写手)

[求助] 请教做过基因染色体整合的大侠们

我现在想做基因染色体整合，看文献中所整合的基因有不同形式的。有的是说所整合的基因带的是自有启动子，但我不明白基因的自有启动子是指什么，ATG开始就可以了还是说前面有一段课本上所说的-35序列什么的？还有的是基因前面加了Ptac或或者T7等启动子，那这些基因是怎么表达的呢，需要IPTG诱导什么的呢还是说不用诱导就可以自己表达了？
      总的就是我想知道我要整合基因是只将该基因ATG到TAA之间的序列整合上去还是说ATG前面应该有什么序列才能保证基因能够正常表达？分子生物学没学好，还望各位不吝赐教，谢谢大家了！
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1楼 2013-12-09 22:22:42
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ...
感谢参与，应助指数 +1
山水88: 金币+20, ★★★很有帮助 2013-12-10 10:11:35
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-12-10 11:04:38
山水88: 金币+30, ★★★★★最佳答案 2013-12-11 12:11:03
启动子是指DNA序列中RNA聚合酶识别并结合的序列。任何基因的表达都是需要有启动子的。ATG是起始密码子，不是启动子。原核生物的启动子是指ATG上游-10和-35的特定序列。启动子有很多，分为诱导型和组成型。常用于做表达的启动子是诱导型的。你说的tac启动子是诱导型的，T7是组成型的。
整合基因到染色体的目的是做表达的话，一般要根据需要加启动子，可以用强启动子，或者诱导启动子（诱导启动子往往和宿主有关）。只克隆起始密码子到终止密码子的话，基因不会表达或者以极低水平的本底表达，通常不能用来研究基因功能。
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2楼2013-12-10 05:47:06
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山水88

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-10 05:47:06
启动子是指DNA序列中RNA聚合酶识别并结合的序列。任何基因的表达都是需要有启动子的。ATG是起始密码子，不是启动子。原核生物的启动子是指ATG上游-10和-35的特定序列。启动子有很多，分为诱导型和组成型。常用于做表 ...

非常感谢您的指导！我还是有以下疑问：
1、我是往大肠杆菌染色体上添加基因，如果是用基因自带启动子，应该就是加上它前面的-10、-35特定序列，也就是大概50bp就可以了吧。但是这有个问题，因为我们是做工程菌，就是想过表达其中几个关键基因，我看过有的文章介绍用质粒载体做表达可能没有在染色体上整合来的稳定，那仅仅是给它单纯的在染色体上添加一个基因拷贝数效果会好吗？
2、你说的T7启动子是组成型启动子，但是pET载体质粒中的表达都要IPTG诱导的，这是怎么回事呢？如果我把要表达的基因ATG前面加上T7启动子序列然后放进染色体中，它会表达吗或者仍然需要IPTG诱导表达？因为我看到T7启动子需要T7 RNA 聚合酶的作用，用DE3化的菌株可以解决这个问题吗？
3、另外就是想请您帮我推荐几种可以直接在染色体上表达的强启动子。
问题比较多，再次感谢！
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3楼2013-12-10 09:18:18
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 山水88 at 2013-12-10 09:18:18
非常感谢您的指导！我还是有以下疑问：
1、我是往大肠杆菌染色体上添加基因，如果是用基因自带启动子，应该就是加上它前面的-10、-35特定序列，也就是大概50bp就可以了吧。但是这有个问题，因为我们是做工程菌，就 ...

1.. -10和-35是狭义上的启动子，一般的启动子要包含更长的序列。如果你要克隆一个基因的启动子，不是50bp就能解决的。整合到染色体上的基因比在质粒上表达稳定，但是由于拷贝数的限制，同样的启动子表达量可能不如在质粒上高。有研究表明增加拷贝在染色体上可以提高表达效果。
2. T7启动子本身不是诱导型的。T7启动子只能被T7 RNA聚合酶识别，而这个酶在原始的大肠杆菌里是没有的，一些工程菌在染色体上整合了T7 RNA聚合酶基因，而这个基因是由lac operon调控的，因而T7启动子下游的基因可以被IPTG诱导。DE3是表达蛋白常用的工程菌株，可以识别T7启动子。
3. 做大肠杆菌表达的话，你提到过的T7和tac都是常用的强启动子。
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4楼2013-12-10 15:13:56
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山水88

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-10 15:13:56
1.. -10和-35是狭义上的启动子，一般的启动子要包含更长的序列。如果你要克隆一个基因的启动子，不是50bp就能解决的。整合到染色体上的基因比在质粒上表达稳定，但是由于拷贝数的限制，同样的启动子表达量可能不如 ...

非常感谢！还是有些不明白的地方想请教您：
1、我怎么找特定基因自身的启动子？
2、我算是又进一步的认识了T7启动子，我是不可以这样认为，我在加上T7启动子之后再给它加上T7 RNA聚合酶基因就可以成为组成型表达了？那么我如果使用DE3化的菌株应该就直接是组成型表达的吧？
3、Tac可以直接添加而组成型表达吗？
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5楼2013-12-10 16:36:14
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 山水88 at 2013-12-10 16:36:14
非常感谢！还是有些不明白的地方想请教您：
1、我怎么找特定基因自身的启动子？
2、我算是又进一步的认识了T7启动子，我是不可以这样认为，我在加上T7启动子之后再给它加上T7 RNA聚合酶基因就可以成为组成型表达 ...

1. 有一些分析基因启动子的软件和online程序，把序列输进去就可以分析。原核生物启动子一般在ATG上游的数百bp之内，保守一些可以克隆1kb。
2. DE3是工程菌株，染色体上有溶原噬菌体整合的T7 RNA聚合酶了，而且是用lacI抑制的，所以pET系列的表达载体在DE3里是诱导表达的。
3. Ptac是一个杂交启动子，被lacI抑制，经IPTG诱导表达。Tac启动子是诱导表达的代表，可以通过诱导剂量来控制表达量，尽管完全抑制时可能有少许本底表达。
基因表达用诱导启动子的优势很明显。因为有些基因产物对宿主有害，在强启动子大量表达下会抑制菌体生长，甚至死亡。
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山水88
6楼2013-12-11 09:14:18
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山水88

木虫 (正式写手)
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6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-11 09:14:18
1. 有一些分析基因启动子的软件和online程序，把序列输进去就可以分析。原核生物启动子一般在ATG上游的数百bp之内，保守一些可以克隆1kb。
2. DE3是工程菌株，染色体上有溶原噬菌体整合的T7 RNA聚合酶了，而且是用 ...

非常感谢您的帮助！
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7楼2013-12-11 12:10:53
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山水88

木虫 (正式写手)
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6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-11 09:14:18
1. 有一些分析基因启动子的软件和online程序，把序列输进去就可以分析。原核生物启动子一般在ATG上游的数百bp之内，保守一些可以克隆1kb。
2. DE3是工程菌株，染色体上有溶原噬菌体整合的T7 RNA聚合酶了，而且是用 ...

您好，抱歉又打扰到您了！
我现在整合做成功了，菌株是自己DE3化的，然后将pET载体上的基因连同T7启动子和终止子（启动子后有lac）一起整合入DE3化的菌株，结果我要的目的产物产量有了提高，但是提高量不是很多，而且整合后的菌株不加IPTG诱导剂才会有所提高，而加了IPTG(1 mM)后的产量几乎与原菌株无差别。跑SDS-PAGE图两者都没有明显蛋白表达量增多。那么请问出现这种现象是为什么呢？按理说应该是添加IPTG后才会表达更多吧，那么如果 这样是不是可以认为我现在的提高是一种基底表达，而真正的表达条件我可能还没有摸索清楚，所以产量反倒因为IPTG的毒性而不会提高呢？
再次感谢！
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8楼2014-05-28 22:30:52
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化学521

新虫 (正式写手)
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8楼: Originally posted by 山水88 at 2014-05-28 22:30:52
您好，抱歉又打扰到您了！
我现在整合做成功了，菌株是自己DE3化的，然后将pET载体上的基因连同T7启动子和终止子（启动子后有lac）一起整合入DE3化的菌株，结果我要的目的产物产量有了提高，但是提高量不是很多， ...

你现在这个问题解决了吗？
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9楼2014-07-02 15:45:20
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山水88

木虫 (正式写手)
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9楼: Originally posted by 化学521 at 2014-07-02 15:45:20
你现在这个问题解决了吗？...

还没弄太明白，你懂么？
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10楼2014-07-02 17:40:01
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