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junxiao0320

金虫 (小有名气)

学生

[求助] 我想知道，pQE30中的T5启动子

pQE30中的T5启动子也是噬菌体里的？为什么会在M15，XLI-blue里表达呢？
寻求确切表述，谢谢
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1楼 2011-11-09 15:52:47
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indica

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-05-08 13:40:34
junxiao0320: 金币+2 2012-05-09 09:10:32
因为这个启动子是靠E.COLI的RNA POLYMERASE来识别，虽说不是噬菌体的RNA POLYMERASE，但是由于强启动子的原因，表达依然很强劲。

大概你是因为T7的原因把这个给混了吧
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2楼2012-05-08 12:09:11
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junxiao0320

金虫 (小有名气)

学生
引用回帖:
4559293楼: Originally posted by indica at 2012-05-08 12:09:11:
因为这个启动子是靠E.COLI的RNA POLYMERASE来识别，虽说不是噬菌体的RNA POLYMERASE，但是由于强启动子的原因，表达依然很强劲。

大概你是因为T7的原因把这个给混了吧

我的确是把它以为跟T7启动子一样是噬菌体启动子。。您有确切的依据吗？对我来说很重要，那么T5可以在一般的大肠杆菌如DH5α里表达吗？
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3楼2012-05-09 09:12:41
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indica

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4560459楼: Originally posted by junxiao0320 at 2012-05-09 09:12:41:
我的确是把它以为跟T7启动子一样是噬菌体启动子。。您有确切的依据吗？对我来说很重要，那么T5可以在一般的大肠杆菌如DH5α里表达吗？

PQE是可以在DH5A中表达的。但该菌株未进行蛋白酶突变，可能有潜在的降解蛋白的风险。

原本的PQE系统是带有lacI的，几乎可以在所有的E.COLI中使用。
但后来Qiagen去了这一功能模块（估计是故意去的），而T5是配合LacO使用的，所以只能在官方的配套菌株中使用。或者在含有lacIq模块的菌株中使用。
而TOP10,或DH10B等野生型lacI 菌株则不适合，因为lacI蛋白数量不足以抑制多拷贝质粒上的T5/lacO的表达，而造成未加诱导剂时的泄露表达，这在表达一些毒蛋白时会造成菌株致死或生长不好。

pQE vectors combine a powerful phage T5 promoter (recognized by E. coli RNA polymerase) with a double lac operator repression module to provide tightly regulated, high-level expression of recombinant proteins in E. coli. Protein synthesis is effectively blocked in the presence of high levels of lac repressor and the stability of cytotoxic constructs is enhanced.
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4楼2012-05-10 08:42:42
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junxiao0320

金虫 (小有名气)

学生
引用回帖:
4561955楼: Originally posted by indica at 2012-05-10 08:42:42:
PQE是可以在DH5A中表达的。但该菌株未进行蛋白酶突变，可能有潜在的降解蛋白的风险。

原本的PQE系统是带有lacI的，几乎可以在所有的E.COLI中使用。
但后来Qiagen去了这一功能模块（估计是故意去的），而T5是 ...

这个意思是我的pQE可以在野生型菌中表达，只是一些毒蛋白会造成菌株致死或生长不好，对吧？
  
   现在我用他的配套菌XLI-BLUE中表达，未加诱导剂之前也存在泄漏表达
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5楼2012-05-10 08:51:14
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indica

铁虫 (初入文坛)
junxiao0320: 回帖置顶 2012-06-26 07:45:41
引用回帖:
4561972楼: Originally posted by junxiao0320 at 2012-05-10 08:51:14
这个意思是我的pQE可以在野生型菌中表达，只是一些毒蛋白会造成菌株致死或生长不好，对吧？
  
   现在我用他的配套菌XLI-BLUE中表达，未加诱导剂之前也存在泄漏表达...

For very toxic proteins, use pQE-80L series of expression vectors in the M15[pREP4] host strain.

-----------------------------------------


Qiagen pQE vector for toxic protein
Example toxic proteins: membrane proteins or proteins that interact with DNA or interfere with electron transport.

1, Do not kept bacteria in culture media or on plates for several days.

2, Grow bacteria cells in the presence of high levels of ampicillin (200 μg/ml) or carbenicillin (50 μg/ml).

3, Do not use overnight starter cultures.

4, Colonies from a fresh plate should be inoculated into a small starter culture and grown for 2–3 hours,
until mid-log phase. This starter culture should then be diluted 20–50-fold in prewarmed medium and grown to an OD600 of approximately 0.5 before induction.

5, For very toxic proteins, use pQE-80L series of expression vectors in the M15[pREP4] host strain.
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6楼2012-06-25 11:37:13
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junxiao0320

金虫 (小有名气)

学生
引用回帖:
4612394楼: Originally posted by indica at 2012-06-25 11:37:13
For very toxic proteins, use pQE-80L series of expression vectors in the M15 host strain.

-----------------------------------------


Qiagen pQE vector for toxic protein
Example toxic protein ...

Thank you very much!
我在表达一个膜蛋白，是不是就像您说的那样应该注意以上几点？
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7楼2012-06-26 07:45:34
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indica

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4613128楼: Originally posted by junxiao0320 at 2012-06-26 07:45:34
Thank you very much!
我在表达一个膜蛋白，是不是就像您说的那样应该注意以上几点？...

你可以用pQE系列试试看。
一直以来膜蛋白都被认为是很有挑战性的表达，
也可以试试C41(DE3)这个菌，是专门做膜蛋白的，买的话很贵，可以问问有木有虫子可以交换。
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8楼2012-06-29 08:12:54
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