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山水88木虫 (正式写手)
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T7启动子表达请教已有3人参与
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我做的是染色体整合，将pET载体上的基因连同T7启动子和终止子（启动子后有lac）一起整合入DE3化的菌株，菌株是自己用试剂盒DE3化的，结果我要的目的产物产量有了提高，但是提高量不是很多，而且整合后的菌株不加IPTG诱导剂才会有所提高，而加了IPTG(1 mM)后的产量几乎与原菌株无差别。跑SDS-PAGE图两者都没有明显蛋白表达量增多。那么请问出现这种现象是为什么呢？按理说应该是添加IPTG后才会表达更多吧，那么如果这样是不是可以认为我现在的提高是一种基底表达，而真正的表达条件我可能还没有摸索清楚，所以产量反倒因为IPTG的毒性而不会提高呢？ 非常感谢大家的应助！ |
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luwei13566
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gyesang: 金币+10, 鼓励交流！ 2014-06-03 00:09:49
山水88: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-06-03 10:25:15
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LZ的基因本来就存在于E.coli基因组中，但是属于低水平的表达, LZ的实验首先是构建了重组pET后转化DE3的E.coli然后诱导发现表达量不高，之后试图通过整合基因组的方法提高拷贝数来增加基因的表达量对吧？ 如果是这个流程我有几点疑问。 1.你首先得分析下含有重组质粒的E.coli表达量不高的原因。是你用的这个宿主菌本身重组质粒的拷贝数就不高？还是后期诱导表达条件的问题？还是你对宿主菌的DE3处理不成功？你先前的对照怎么做的，拿重组质粒转化子和空载转化子用等量的IPTG诱导一次对比一下。如果表达量低首先考虑诱导条件的问题，LZ上面给出的诱导温度太高了。超过30度诱导效果会逐渐下降，按你的温度来看诱导效果非常差，诱导的蛋白甚至可能都是包涵体，我都是用25—28度诱导的，菌体OD0.6差不多，到0.8也行，IPTG 0.5mM就足够了，我一般用0.25mM，你菌体本身OD就不高，加的IPTG又多自然对细胞的负荷就大。还有你用的摇瓶还是试管诱导的？体系的溶氧量对诱导影响也很大。当你把所有的优化做完表达量还是上不去，排除了包涵体、载体本身和对宿主菌的DE3处理是否成功的问题后，那只可能是你的载体和你用的宿主菌不兼容，拷贝数很低，无法通过重组质粒诱导，所以你才做基因组整合。 2.你重组后不诱导蛋白量有提高，诱导后就没变化了。你确定不诱导前表达量提高是因为基因整合而产生效果而不是因为菌体OD不同而导致的误差？你用IPTG没有效果是不是你对菌株的DE3处理不成功？如果DE3是成功的话那你的基因前面确实带着T7启动子吗，启动子完整不完整？或者还是诱导条件的问题？或者你整合的拷贝数也不高？你现在的问题是你整合的基因到底诱导表达了没有，最好是做个杂交验证下。 3.你的菌在IPTG诱导的时候不长还是你IPTG浓度的问题，如果是溶原噬菌体污染应该是菌体OD值正常升高到一定程度后突然OD值又开始迅速下降到一个很低的状态，而不可能一致维持在某个浓度下不动。再说你用于DE3处理的噬菌体都是把触发裂解步骤的序列全部敲除掉后的灭活噬菌体，很安全的。 |
9楼2014-06-02 04:31:38
luwei13566
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【答案】应助回帖
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山水88: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-06-03 10:25:30
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针对LZ的实验我再提一些疑问吧 1.你是用终产物的产量来表征你表达是否成功的吗？我觉得这里有待讨论，我认为把基因弄到载体上导入宿主表达成功的标准还是看最后表达出来的蛋白量多不多。LZ前期用质粒表达蛋白后产物量上升，这和你这个实验的立足点~表达酶量增加导致底物产量提高是一致的，你也应该跑了page和对照比较目标蛋白有明显的差异。后期由于质粒的不稳定性LZ做了整合，而且诱导表达发现整合的比质粒的底物生成量更高。但是整合后你也说了page看不到明显的蛋白增加，那现在你质粒诱导的蛋白和整合的比较哪一个目标蛋白表达量更多？ 2.你要表达的这个酶蛋白是胞外还是胞内，如果是胞外酶的话有些载体上自带有引导肽序列会不会影响你的蛋白的信号肽序列？你测定的是底物的生成量应该是收集了发酵液上清测定的吧，那这个底物的代谢途径是怎样的？是先到胞内水解成产物再出来还是直接在胞外就转化掉了？如果是转移到胞内是被动扩散还是主动运输？如果是需要相应的转运蛋白辅助转运转出，那这个因素对你底物转化的影响会不会比你要表达的酶的影响更大呢， 3.你的菌株是什么菌啊？有些菌株属于乳糖不敏感菌株，如果是这类菌株的话IPTG添加量应该更低一些，你上面说的整合后基因拷贝数只增加了一个，那原先这个基因在基因组上拷贝数是不是也不高呀，要不然增加了一个拷贝，蛋白也没多多少，但是产物却多了不少。 4.你T7启动子后面的lac operater是专门用来防止渗透表达的，因为阻遏蛋白也在这里结合，这种情况需要更多的IPTG来解除抑制才能正常表达，但是你的lacI丢了后又会促进渗透表达。所以你整合的基因可能还是属于微量渗透表达。你现在的结果是整合菌和都不添加IPTG的那两个菌比产物量提高了，那么你这个整合菌株不诱导和诱导后对比产物量哪个高哪个低？原始菌株不加IPTG和加IPTG后哪个高？带质粒的菌呢？ 5.我感觉你的实验应该把蛋白的表达和底物转化两部分分开，先把每个菌株每个阶段蛋白的表达给弄清楚，再来讨论底物的转化，要不然内容会比较乱，也不好分析结果。 |
11楼2014-06-03 01:25:40
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