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happywoheni

铁虫 (小有名气)

[求助] 基因表达宿主菌问题

用pet28a做载体，可以用大肠DH5a做表达宿主菌吗？
提pet28a质粒时，有没有可能把基因组给提出来？我提的只有一条带，而且比5000大挺多。
质粒和pcr产物双酶切后要电泳检测吗？
双酶切时，两个位点相差几十个bp，电泳能判断是否切开吗？
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1楼2011-08-17 14:34:38
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
happywoheni(金币+1): 2011-08-17 15:10:06
西瓜(金币+2): Good！表达蛋白的话，DH5α并不是最佳的。 2011-08-17 18:56:07
DH5a多用于做为为克隆菌株，表达菌可用NOvagen的，楼主可以找代理公司问下，常用的有BL21，Transetta等，楼主最好测序后再表达，确保序列正确，有相应的测序引物！
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jiayoubashaonian
2楼2011-08-17 14:58:31
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xbl3688

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
1949stone(金币+2): 很好 2011-08-17 16:23:30
1、提质粒时是有可能把总DNA提出来的，一般在1W以上，PET28a才5300多，应该容易分辨的，如果大很多就可能不是了。但是质粒一般有2-3条带，不能单靠某一条带判定它的大小。
2、对质粒双酶切后（假设只是切掉几十个bp），条带就比较单一了，可以对照Marker来判定是不是该质粒。
3、质粒和pcr产物双酶切后可以先用琼脂糖凝胶小样验证，确认之后再跑大量的琼脂糖凝胶，切胶回收可以得到酶切后的片段。
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生活的乐趣在于善于发现美，学会欣赏美
3楼2011-08-17 15:10:13
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happywoheni

铁虫 (小有名气)
序列是正确的，已经测过序了。我有现成的大肠DH5a感受态细胞，所以想问一下可不可以作表达宿主
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4楼2011-08-17 15:11:47
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happywoheni

铁虫 (小有名气)
BL21可以用来表达PET系列吗？好像听说不太适合吧
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5楼2011-08-17 15:35:04
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imfly77

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good！学习了哦！ 2011-08-17 18:57:01
引用回帖:
1楼: Originally posted by happywoheni at 2011-08-17 14:34:38:
用pet28a做载体，可以用大肠DH5a做表达宿主菌吗？
提pet28a质粒时，有没有可能把基因组给提出来？我提的只有一条带，而且比5000大挺多。
质粒和pcr产物双酶切后要电泳检测吗？
双酶切时，两个位点相差几十个bp ...

关于pET28a在DH5alpha里的表达问题，可以看这个帖子
http://abgfxh.blog.163.com/blog/static/9142920720112312432668/
"DH5a中表达时外源基因的启动子必须被大肠杆菌的RNA POLYMERASE 识别，比较好用的载体有PLPR可诱导的启动子。而带有T7 启动子的载体则不能在其中表达，因为识别T7 启动子的T7 RNA POLYMERASE 在DH5a中没有。"
pET28a启动子是T7，不能在DH5alpha里表达，还是用BL21(DE3)吧，表达量也高。

提质粒如果按照试剂盒的protocol进行的话是不会有问题的。环状质粒条带位置通常都会和质粒大小有一定差异，要检验的话可以用质粒上有唯一位点的限制酶做单酶切检验，这样的位置和大小就是匹配的。
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6楼2011-08-17 16:54:01
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happywoheni

铁虫 (小有名气)
这个……以前没查清楚，以为DH5a也可以，所以买了天根的DH5a的感受态，有没有人有BL21(DE3)菌啊？来个交换！
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7楼2011-08-17 19:27:05
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