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xujingyuanxu

铜虫 (正式写手)

[求助] DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染不显示带 已有3人参与

最近再做分子标记，由于水平胶跑不出条带，就改用垂直胶来跑。用银染法显色。之前做过几次染色还算成功，之后再做就效果不好，根据文献改动了显影方法，可是最近几天跑胶染色的结果是全部白板，连Marker都染不出来。之前的方法：乙醇固定，漂洗，硝酸浸泡，漂洗，硝酸银染色，漂洗，加甲醛的碳酸钠显影；现在把硝酸浸泡这一步省去了，加甲醛的碳酸钠显影，硝酸银染色时间从20mins加至30分钟，漂洗变为一次，但是最近连Marker也无法染出来。有时候只有一块板有显影，其它几块都不显，不知道哪里出了问题，求指导。如果是PCR的问题，为什么Marker也染不出；如果是染色的问题，为什么有时候能部分染色？还有就是硝酸浸泡是什么作用！万分感谢！
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1楼 2014-05-27 16:34:41
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飞约疯人院

专家顾问 (著名写手)

科学怪人
引用回帖:
4楼: Originally posted by xujingyuanxu at 2014-05-27 20:21:59
谢谢您的帮助！我想问一下，您说的DNA降解的严重是指模板还是扩增产物呢？第二，据我了解SSR，SRAP，AFLP等分子标记也是用PAGE胶跑的啊！还有就是我扩增的产物在琼脂糖胶跑的不好，不怎么显，所以改用PAGE胶。我最 ...

1 降解指的就是模板
2 分子标记的重现性特别差，我用的是SSR和SRAP，基本用琼脂糖就好，最好是EB染色，PAGE多麻烦啊
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人生贵在行动，迟疑不决时，不妨先迈出小小一步。
5楼2014-05-27 20:28:32
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飞约疯人院

专家顾问 (著名写手)

科学怪人

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-05-27 18:51:27
分子标记不用垂直胶吧，水平胶如果不出来，问题就可能涉及以下几个方面：
1 DNA降解厉害
2 分子标记的引物出现问题
3 分子标记PCR体系不对
4 分子标记时PCR退火温度过高或过低

建议：做一个touchdown PCR ， 感觉不是PAGE试验的问题
谢谢！
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人生贵在行动，迟疑不决时，不妨先迈出小小一步。
2楼2014-05-27 16:45:29
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xujingyuanxu

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 飞约疯人院 at 2014-05-27 16:45:29
分子标记不用垂直胶吧，水平胶如果不出来，问题就可能涉及以下几个方面：
1 DNA降解厉害
2 分子标记的引物出现问题
3 分子标记PCR体系不对
4 分子标记时PCR退火温度过高或过低

建议：做一个touchdown PCR ， ...

谢谢您的帮助！我想问一下，您说的DNA降解的严重是指模板还是扩增产物呢？第二，据我了解SSR，SRAP，AFLP等分子标记也是用PAGE胶跑的啊！还有就是我扩增的产物在琼脂糖胶跑的不好，不怎么显，所以改用PAGE胶。我最困惑的是同样的条件之前还能扩增的不错，染色也挺好，第二天再做就效果很差，显不出什么东西来，求指导！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2014-05-27 20:21:59
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xujingyuanxu

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 飞约疯人院 at 2014-05-27 20:28:32
1 降解指的就是模板
2 分子标记的重现性特别差，我用的是SSR和SRAP，基本用琼脂糖就好，最好是EB染色，PAGE多麻烦啊...

EB我们没用，我们的琼脂糖胶用Goldview.我想问一下当时你们做水平电泳的时候上样量一般是多少啊？还有如果用PAGE 胶，那么银染的时候用硝酸处理么？谢谢
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6楼2014-05-28 15:33:31
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