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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染不显示带
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xujingyuanxu

铜虫 (正式写手)

[求助] DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染不显示带 已有3人参与

最近再做分子标记，由于水平胶跑不出条带，就改用垂直胶来跑。用银染法显色。之前做过几次染色还算成功，之后再做就效果不好，根据文献改动了显影方法，可是最近几天跑胶染色的结果是全部白板，连Marker都染不出来。之前的方法：乙醇固定，漂洗，硝酸浸泡，漂洗，硝酸银染色，漂洗，加甲醛的碳酸钠显影；现在把硝酸浸泡这一步省去了，加甲醛的碳酸钠显影，硝酸银染色时间从20mins加至30分钟，漂洗变为一次，但是最近连Marker也无法染出来。有时候只有一块板有显影，其它几块都不显，不知道哪里出了问题，求指导。如果是PCR的问题，为什么Marker也染不出；如果是染色的问题，为什么有时候能部分染色？还有就是硝酸浸泡是什么作用！万分感谢！
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我努力，我坚持，我成功！
1楼 2014-05-27 16:34:41
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飞约疯人院

专家顾问 (著名写手)

科学怪人

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-05-27 18:51:27
分子标记不用垂直胶吧，水平胶如果不出来，问题就可能涉及以下几个方面：
1 DNA降解厉害
2 分子标记的引物出现问题
3 分子标记PCR体系不对
4 分子标记时PCR退火温度过高或过低

建议：做一个touchdown PCR ， 感觉不是PAGE试验的问题
谢谢！
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人生贵在行动，迟疑不决时，不妨先迈出小小一步。
2楼2014-05-27 16:45:29
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fhlxojs

木虫 (小有名气)
顶一下师兄
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天道酬勤
3楼2014-05-27 17:15:01
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xujingyuanxu

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 飞约疯人院 at 2014-05-27 16:45:29
分子标记不用垂直胶吧，水平胶如果不出来，问题就可能涉及以下几个方面：
1 DNA降解厉害
2 分子标记的引物出现问题
3 分子标记PCR体系不对
4 分子标记时PCR退火温度过高或过低

建议：做一个touchdown PCR ， ...

谢谢您的帮助！我想问一下，您说的DNA降解的严重是指模板还是扩增产物呢？第二，据我了解SSR，SRAP，AFLP等分子标记也是用PAGE胶跑的啊！还有就是我扩增的产物在琼脂糖胶跑的不好，不怎么显，所以改用PAGE胶。我最困惑的是同样的条件之前还能扩增的不错，染色也挺好，第二天再做就效果很差，显不出什么东西来，求指导！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2014-05-27 20:21:59
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飞约疯人院

专家顾问 (著名写手)

科学怪人
引用回帖:
4楼: Originally posted by xujingyuanxu at 2014-05-27 20:21:59
谢谢您的帮助！我想问一下，您说的DNA降解的严重是指模板还是扩增产物呢？第二，据我了解SSR，SRAP，AFLP等分子标记也是用PAGE胶跑的啊！还有就是我扩增的产物在琼脂糖胶跑的不好，不怎么显，所以改用PAGE胶。我最 ...

1 降解指的就是模板
2 分子标记的重现性特别差，我用的是SSR和SRAP，基本用琼脂糖就好，最好是EB染色，PAGE多麻烦啊
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5楼2014-05-27 20:28:32
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xujingyuanxu

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 飞约疯人院 at 2014-05-27 20:28:32
1 降解指的就是模板
2 分子标记的重现性特别差，我用的是SSR和SRAP，基本用琼脂糖就好，最好是EB染色，PAGE多麻烦啊...

EB我们没用，我们的琼脂糖胶用Goldview.我想问一下当时你们做水平电泳的时候上样量一般是多少啊？还有如果用PAGE 胶，那么银染的时候用硝酸处理么？谢谢
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6楼2014-05-28 15:33:31
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飞约疯人院

专家顾问 (著名写手)

科学怪人
引用回帖:
6楼: Originally posted by xujingyuanxu at 2014-05-28 15:33:31
EB我们没用，我们的琼脂糖胶用Goldview.我想问一下当时你们做水平电泳的时候上样量一般是多少啊？还有如果用PAGE 胶，那么银染的时候用硝酸处理么？谢谢...

10ulPCR产物加上1ulloadding buffer ，Eb每20ml加1ul， goldenview没有EB好，他只是EB替代物
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7楼2014-05-28 15:39:00
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冬角开心草

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
xujingyuanxu(晞朔代发): 金币+1 2015-05-17 13:39:39
我们不用硝酸浸泡，硝酸银10分钟后漂洗两次再加氢氧化钠的显色液+甲醛10分钟
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先零落成泥，后繁花似锦。。
8楼2015-01-21 08:58:07
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
xujingyuanxu(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-07-14 22:44:22
1. 首先确定电泳是否电压过高且没有通循环水降温或在低温冰箱里跑胶造成连MARKER都降解了？？
2. 如果排除降解因素，就在胶配置，显影因素上考虑，楼主不能只考虑显影本身的问题哈
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9楼2015-01-21 09:25:52
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88mc

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 飞约疯人院 at 2014-05-27 20:28:32
1 降解指的就是模板
2 分子标记的重现性特别差，我用的是SSR和SRAP，基本用琼脂糖就好，最好是EB染色，PAGE多麻烦啊...

我们也是SSR标记，大概都是100—200的大小，共显性标记，一直用PAGE,也试过琼脂糖，但是看不出差异啊，请问你们具体是怎么用琼脂糖跑出差异的。
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10楼2015-05-17 09:23:17
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