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xujingyuanxu

铜虫 (正式写手)

[求助] DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染不显示带 已有3人参与

最近再做分子标记,由于水平胶跑不出条带,就改用垂直胶来跑。用银染法显色。之前做过几次染色还算成功,之后再做就效果不好,根据文献改动了显影方法,可是最近几天跑胶染色的结果是全部白板,连Marker都染不出来。之前的方法:乙醇固定,漂洗,硝酸浸泡,漂洗,硝酸银染色,漂洗,加甲醛的碳酸钠显影;现在把硝酸浸泡这一步省去了,加甲醛的碳酸钠显影,硝酸银染色时间从20mins加至30分钟,漂洗变为一次,但是最近连Marker也无法染出来。有时候只有一块板有显影,其它几块都不显,不知道哪里出了问题,求指导。如果是PCR的问题,为什么Marker也染不出;如果是染色的问题,为什么有时候能部分染色?还有就是硝酸浸泡是什么作用!万分感谢!
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飞约疯人院

专家顾问 (著名写手)

科学怪人

引用回帖:
6楼: Originally posted by xujingyuanxu at 2014-05-28 15:33:31
EB我们没用,我们的琼脂糖胶用Goldview.我想问一下当时你们做水平电泳的时候上样量一般是多少啊?还有如果用PAGE 胶,那么银染的时候用硝酸处理么?谢谢...

10ulPCR产物加上1ulloadding buffer ,Eb每20ml加1ul, goldenview没有EB好,他只是EB替代物
人生贵在行动,迟疑不决时,不妨先迈出小小一步。
7楼2014-05-28 15:39:00
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飞约疯人院

专家顾问 (著名写手)

科学怪人

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流! 2014-05-27 18:51:27
分子标记不用垂直胶吧,水平胶如果不出来,问题就可能涉及以下几个方面:
1 DNA降解厉害
2 分子标记的引物出现问题
3 分子标记PCR体系不对
4 分子标记时PCR退火温度过高或过低

建议:做一个touchdown PCR , 感觉不是PAGE试验的问题
谢谢!
人生贵在行动,迟疑不决时,不妨先迈出小小一步。
2楼2014-05-27 16:45:29
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xujingyuanxu

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 飞约疯人院 at 2014-05-27 16:45:29
分子标记不用垂直胶吧,水平胶如果不出来,问题就可能涉及以下几个方面:
1 DNA降解厉害
2 分子标记的引物出现问题
3 分子标记PCR体系不对
4 分子标记时PCR退火温度过高或过低

建议:做一个touchdown PCR , ...

谢谢您的帮助!我想问一下,您说的DNA降解的严重是指模板还是扩增产物呢?第二,据我了解SSR,SRAP,AFLP等分子标记也是用PAGE胶跑的啊!还有就是我扩增的产物在琼脂糖胶跑的不好,不怎么显,所以改用PAGE胶。我最困惑的是同样的条件之前还能扩增的不错,染色也挺好,第二天再做就效果很差,显不出什么东西来,求指导!

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2014-05-27 20:21:59
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飞约疯人院

专家顾问 (著名写手)

科学怪人

引用回帖:
4楼: Originally posted by xujingyuanxu at 2014-05-27 20:21:59
谢谢您的帮助!我想问一下,您说的DNA降解的严重是指模板还是扩增产物呢?第二,据我了解SSR,SRAP,AFLP等分子标记也是用PAGE胶跑的啊!还有就是我扩增的产物在琼脂糖胶跑的不好,不怎么显,所以改用PAGE胶。我最 ...

1 降解指的就是模板
2 分子标记的重现性特别差,我用的是SSR和SRAP,基本用琼脂糖就好,最好是EB染色,PAGE多麻烦啊
人生贵在行动,迟疑不决时,不妨先迈出小小一步。
5楼2014-05-27 20:28:32
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