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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光定量PCR 模板问题
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宁宁0320

新虫 (初入文坛)

[求助] 荧光定量PCR 模板问题 已有2人参与

想做某种昆虫不同发育阶段体内某种菌的大概趋势，想做相对定量PCR，看有人用DNA做定量的，不是很明白，直接用DNA做定量和反转录做定量的区别？？分别适合什么情况？
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1楼 2014-05-21 09:29:46
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宁宁0320

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 燕归来0101 at 2014-05-22 21:18:10
如果是看这种菌的含量变化，我觉得做绝对定量吧，构建标曲，然后在不同生长阶段取样品。我现在要做植物的含菌量变化，应该差不多，不过平行可能要多设置一些。

亲太感谢你回复我的帖子了，好几天都没人理我呀，我的这个虫子有5个若虫龄期，我想做5个若虫龄期和卵期，成虫阶段，菌量变化，我是刚刚接触定量，本想简单一点做个相对定量，但是好些东西还不太明白，
    1. 若是我做绝对定量，我这7个样本需要做几个标曲呢？虫子卵和一龄阶段虫龄很小，不好收集，提RNA很难呢，我看有人做其他虫的是仅仅做一个刚刚羽化的成虫的标曲。
    2.做标曲有做DNA 标曲的吗？
    3.相对定量其实模板浓度要一致吗？像我这种情况直接用DNA做相对定量，模板浓度很难控制.
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共生菌寻求实验盟友，互帮互助，实验进步
4楼2014-05-23 09:08:44
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燕归来0101

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果是看这种菌的含量变化，我觉得做绝对定量吧，构建标曲，然后在不同生长阶段取样品。我现在要做植物的含菌量变化，应该差不多，不过平行可能要多设置一些。
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2楼2014-05-22 21:18:10
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燕归来0101

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

还有，相对定量应该是看某种基因的表达量是上调还是下调了，所以需要先提取RNA，再反转录。你这个看菌量变化应该不用做RNA的。
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3楼2014-05-22 21:20:06
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yangzwty

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

1. 7格样本只需要做一个标曲，做标曲的目的是确定一下你模板的稀释倍数。
2. 一般都是用cDNA做标曲的。
3.相对定量的模板浓度时一致的。
祝你成功！
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5楼2014-06-16 15:47:09
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