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表达载体的转化实验 已有5人参与
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| T载体的转化，我使用的是DH5a 感受态。准备做表达，看了一些文献，好像表达载体都用的BL21,两种感受态有什么区别？表达过程不能用DH5a 吗 |
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【答案】应助回帖
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首先你需明白几个不同的概念，1. T载体是克隆载体，你的基因通过TA克隆法插入载体，这一步的目的是扩增基因，得到大量你要的目的基因片段，以便进行下一步表达载体的构建；DH5α是克隆菌株，不能用来做表达；2. 欲在大肠杆菌中表达外源基因，需要首先构建原核表达载体，如可将构建至T载体的目的通过双酶切切下来然后连接到表达载体上，如PET系列的载体等，构建成原核表达载体后，可将此载体转化表达菌株，如BL21(DE3,)等，如果你的目的基因含有稀有密码子，也可以转化Rosetta系列的表达菌株。最后将构建成功的基因工程菌进行诱导表达。 祝好！ |
3楼2014-05-16 13:01:57
zhaozhibozhi
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2楼2014-05-16 10:39:11
鬼羽帝魂
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5楼2014-05-17 17:18:05
【答案】应助回帖
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楼上诸位已经回答得很清楚了。我再补充几点： 1、T载体常用于克隆，一般来讲都会再把目的基因亚克隆到表达载体上。但是并非T载体不能用来表达。常见的pMD18-T，含有lacZ操纵子，可以IPTG诱导表达。pGEM-T则含有T7和SP6启动子。 2、为了能够顺利地使用T7系统来表达蛋白，在如BL21（DE3）一类的大肠杆菌菌株中，编码T7RNA聚合酶的基因被整合到其染色体上，并位于lacUV5启动子的下游，受乳糖操纵子调控。而目标蛋白的编码序列则被构建到含T7启动子序列的质粒上，并受T7RNA聚合酶调控转录。 3、构建质粒、基因表达看似比较成熟，也比较简单。其实这里面大有学问。学会看菌株和质粒的相关文档，答案就在其中。 补充一个与原题无关的知识：大家都知道蓝白斑筛选哈，不知道的去看教材。DH5a菌株可以用蓝白斑筛选，BL21不行。具体原因感兴趣的google。 |
6楼2014-05-17 22:19:00
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