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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助：荧光定量结果与转录组结果测序结果不一致是怎么回事？
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nongke2012

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助：荧光定量结果与转录组结果测序结果不一致是怎么回事？ 已有3人参与

利用SybrGreen法进行荧光定量，验证转录组测序中的差异表达基因，然而荧光定量的结果与转录组测序结果相差很大，例如，在转录组测序中，基因A在a,b两个材料中的表达量分别为0.02和3.5，相差50倍以上，然而荧光定量的相对表达量相差不到两倍,有时甚至a中的表达量高于b,这是什么原因？引物的溶解曲线为单峰，可排除引物非特异性的原因
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1楼 2014-05-11 20:28:52
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liutonglu

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-05-12 09:32:08
这是很正常的现象，转录组数据得到的结果只能作为参考，稍微一个参数的改变都会造成结果的不同。所以采样进行qPCR验证，所以的表达结果以实时定量PCR为准。
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2楼2014-05-11 23:49:10
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nongke2012

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by liutonglu at 2014-05-11 23:49:10
这是很正常的现象，转录组数据得到的结果只能作为参考，稍微一个参数的改变都会造成结果的不同。所以采样进行qPCR验证，所以的表达结果以实时定量PCR为准。

那是说明转录组测序有问题吗？还是染料法荧光定量准确性低
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3楼2014-05-12 14:32:13
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liutonglu

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by nongke2012 at 2014-05-12 14:32:13
那是说明转录组测序有问题吗？还是染料法荧光定量准确性低...

转录组数据没有问题，但是转录组测序是测所有的mRNA，肯定有bias，也就是偏好性，最理想的状态当然是测到的表达量和实际的一致，但实际上由于bias的存在某些片段会被多次测到，而某些测到的概率低，如果不明白你就找点这方面文献看看，qPCR是特异选择某一个基因，所以是准确的。所有的表达都要以qPCR为准。
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4楼2014-05-13 17:42:46
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大爷给跪了

新虫 (小有名气)
正常。其实很多人发文章，做验证，你看到的结果都是很好，其实说不定别人做了100个就10个合适，其他都不行，但是文章上就放了10个，你也不知道

有很多人相信荧光定量比转录组测序准，我倒觉得转录组测序更准。荧光定量是通过光来判断量，但是转录组是直接进行测序，通过reads来判断，通过rpkm来判断，感觉比荧光准
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5楼2014-05-14 10:16:57
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大爷给跪了

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by liutonglu at 2014-05-13 17:42:46
转录组数据没有问题，但是转录组测序是测所有的mRNA，肯定有bias，也就是偏好性，最理想的状态当然是测到的表达量和实际的一致，但实际上由于bias的存在某些片段会被多次测到，而某些测到的概率低，如果不明白你就 ...

求传点关于bias的文章看看，我一直觉得测序比荧光准，没想到还有偏好性，求啊求啊
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6楼2014-05-14 10:20:37
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
转录组测序的时候也是打断了测小片段的，后面需要拼接，如果比较相似性很高的基因，转录组数据很难说精准的，那个数据仅供参考，后续的qPCR还是必须做的

[ 发自小木虫客户端 ]
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7楼2014-05-14 10:24:19
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大爷给跪了

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-05-14 10:24:19
转录组测序的时候也是打断了测小片段的，后面需要拼接，如果比较相似性很高的基因，转录组数据很难说精准的，那个数据仅供参考，后续的qPCR还是必须做的

http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=5681672这个贴子里有个人给了解释，在扩增的时候扩增有偏好性。测基因组还行，转录组就不行了
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8楼2014-05-14 11:17:51
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shucanwei

木虫 (正式写手)
学习了，
楼主可有进展？
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唯以一人治天下，不以天下奉一人。
9楼2014-12-29 22:07:58
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luyan00_00

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by nongke2012 at 2014-05-12 14:32:13
那是说明转录组测序有问题吗？还是染料法荧光定量准确性低...

生物小白一枚。各位大师，去年的师姐已经做过转录组测序，现在倒是要求做荧光定量。原来的实验材料已经没有了，做出的结果能作为参考依据验证差异表达吗
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10楼2016-11-25 10:03:09
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