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nongke2012

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助:荧光定量结果与转录组结果测序结果不一致是怎么回事? 已有3人参与

利用SybrGreen法进行荧光定量,验证转录组测序中的差异表达基因,然而荧光定量的结果与转录组测序结果相差很大,例如,在转录组测序中,基因A在a,b两个材料中的表达量分别为0.02和3.5,相差50倍以上,然而荧光定量的相对表达量相差不到两倍,有时甚至a中的表达量高于b,这是什么原因?引物的溶解曲线为单峰,可排除引物非特异性的原因
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liutonglu

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-05-12 09:32:08
这是很正常的现象,转录组数据得到的结果只能作为参考,稍微一个参数的改变都会造成结果的不同。所以采样进行qPCR验证,所以的表达结果以实时定量PCR为准。
2楼2014-05-11 23:49:10
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nongke2012

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by liutonglu at 2014-05-11 23:49:10
这是很正常的现象,转录组数据得到的结果只能作为参考,稍微一个参数的改变都会造成结果的不同。所以采样进行qPCR验证,所以的表达结果以实时定量PCR为准。

那是说明转录组测序有问题吗?还是染料法荧光定量准确性低
3楼2014-05-12 14:32:13
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liutonglu

金虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by nongke2012 at 2014-05-12 14:32:13
那是说明转录组测序有问题吗?还是染料法荧光定量准确性低...

转录组数据没有问题,但是转录组测序是测所有的mRNA,肯定有bias,也就是偏好性,最理想的状态当然是测到的表达量和实际的一致,但实际上由于bias的存在某些片段会被多次测到,而某些测到的概率低,如果不明白你就找点这方面文献看看,qPCR是特异选择某一个基因,所以是准确的。所有的表达都要以qPCR为准。
4楼2014-05-13 17:42:46
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大爷给跪了

新虫 (小有名气)

正常。其实很多人发文章,做验证,你看到的结果都是很好,其实说不定别人做了100个就10个合适,其他都不行,但是文章上就放了10个,你也不知道

有很多人相信荧光定量比转录组测序准,我倒觉得转录组测序更准。荧光定量是通过光来判断量,但是转录组是直接进行测序,通过reads来判断,通过rpkm来判断,感觉比荧光准
5楼2014-05-14 10:16:57
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大爷给跪了

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by liutonglu at 2014-05-13 17:42:46
转录组数据没有问题,但是转录组测序是测所有的mRNA,肯定有bias,也就是偏好性,最理想的状态当然是测到的表达量和实际的一致,但实际上由于bias的存在某些片段会被多次测到,而某些测到的概率低,如果不明白你就 ...

求传点关于bias的文章看看,我一直觉得测序比荧光准,没想到还有偏好性,求啊求啊
6楼2014-05-14 10:20:37
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
转录组测序的时候也是打断了测小片段的,后面需要拼接,如果比较相似性很高的基因,转录组数据很难说精准的,那个数据仅供参考,后续的qPCR还是必须做的

[ 发自小木虫客户端 ]
7楼2014-05-14 10:24:19
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大爷给跪了

新虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-05-14 10:24:19
转录组测序的时候也是打断了测小片段的,后面需要拼接,如果比较相似性很高的基因,转录组数据很难说精准的,那个数据仅供参考,后续的qPCR还是必须做的

http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=5681672这个贴子里有个人给了解释,在扩增的时候扩增有偏好性。测基因组还行,转录组就不行了
8楼2014-05-14 11:17:51
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shucanwei

木虫 (正式写手)

学习了,
楼主可有进展?
唯以一人治天下,不以天下奉一人。
9楼2014-12-29 22:07:58
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luyan00_00

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by nongke2012 at 2014-05-12 14:32:13
那是说明转录组测序有问题吗?还是染料法荧光定量准确性低...

生物小白一枚。各位大师,去年的师姐已经做过转录组测序,现在倒是要求做荧光定量。原来的实验材料已经没有了,做出的结果能作为参考依据验证差异表达吗
10楼2016-11-25 10:03:09
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