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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » His tag结合问题
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wulie0411

木虫 (小有名气)

[求助] His tag结合问题 已有2人参与

我纯化了一个C端带His tag的蛋白，这个蛋白希望用于SPR检测。但是SPR芯片表面修饰了Ni-NTA之后，蛋白结合不到Ni-NTA上，蛋白纯化即是通过his-tag实现的，可是纯化之后缺无法结合到Ni-NTA表面，无法结合到修饰了Ni-NTA的SPR芯片的蛋白还是可以挂到Ni柱上。 修饰了Ni-NTA的SPR芯片结合其他his-tag蛋白没有任何问题。求助各位大侠，这究竟是怎么回事。。。。。
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1楼 2014-05-10 12:19:53
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wulie0411

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2014-05-10 20:55:58
结合常数的问题吧

修饰在SPR表面的Ni-NTA对目的蛋白吸附能力明显下降了，而你的蛋白对这个修饰很敏感。

以下是我的猜测，你的目的蛋白对Ni-NTA的吸附能力相比于其它的His蛋白而言，比较弱

文献中都是使用这种方法抓的这个蛋白，可是我却怎么也弄不出来，苦闷
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5楼2014-05-12 20:43:37
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
youlinglyw: 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，生物科学有你更精彩！ 2014-05-12 22:30:17
结合常数的问题吧

修饰在SPR表面的Ni-NTA对目的蛋白吸附能力明显下降了，而你的蛋白对这个修饰很敏感。

以下是我的猜测，你的目的蛋白对Ni-NTA的吸附能力相比于其它的His蛋白而言，比较弱
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行至水穷处，坐看云起时
2楼2014-05-10 20:55:58
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BioChemCom

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
youlinglyw: 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，生物科学有你更精彩！ 2014-05-12 22:30:27
你确定纯化到的蛋白是目的蛋白？His-tag的结合亲和性都很强的，SPR没有抓住，很可能你纯化的蛋白是杂蛋白。如果蛋白确定是目的蛋白，再考虑其它可能。

His-tag的亲和性受到几个因素的影响：1. 与蛋白本身的构象关系；2. pH值（这个可能性小）；
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3楼2014-05-12 08:00:10
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wulie0411

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by BioChemCom at 2014-05-12 08:00:10
你确定纯化到的蛋白是目的蛋白？His-tag的结合亲和性都很强的，SPR没有抓住，很可能你纯化的蛋白是杂蛋白。如果蛋白确定是目的蛋白，再考虑其它可能。

His-tag的亲和性受到几个因素的影响：1. 与蛋白本身的构象关 ...

几乎可以确定是目的蛋白，因为目的蛋白是有颜色的，可以很明显的观察到。很久以前我曾今成功的抓到过，效果也很好，现在无论如何也抓不到了，郁闷啊。
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4楼2014-05-12 20:42:20
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