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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 阳性克隆的鉴定
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崔永霞

铁虫 (小有名气)

[求助] 阳性克隆的鉴定 已有2人参与

各位高手，我转化重组质粒后得到了9个单克隆，经菌落PCR验证是阳性克隆，但双酶切只有一条带，这是什么原因啊？我又以重组质粒为模板，分别以载体的上游引物和目的基因的下游引物扩增也得到的目的片段啊？
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每个人都有心底最柔软的地方，请不要触碰它，因为每个人都有自己的尊严！
1楼 2014-04-30 17:41:47
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zep616745243

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 崔永霞 at 2014-05-01 09:41:04
双酶切条带和单酶切条带大小不一致，双酶切条带比单酶切条带稍微考上一点。...

设计上下游引物时是否带有双酶切位点，若有的话用这两个酶切应该不会出现这种情况，前提是双酶切位点选择正确；若引物木有加酶切位点，那么双酶切还要考虑保证不切到目的序列。好好分析下序列酶切位点
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只有不断地失败才会成功
6楼2014-05-01 12:29:03
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
崔永霞(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-30 20:02:42
崔永霞: 金币+19, ★★★很有帮助, 谢谢！ 2014-05-01 09:39:07
你做一个单酶切试试，以空载体做对照

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2014-04-30 18:28:13
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zep616745243

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-04-30 23:15:26
maybe  有一个酶没切动，看下条带是否和单酶切大小一致
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只有不断地失败才会成功
3楼2014-04-30 20:33:31
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崔永霞

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-04-30 18:28:13
你做一个单酶切试试，以空载体做对照

你的意思是分别切空载体和重组质粒？我做过单酶切，单酶切反而在1400bp出也有一条带(我的目的基因是1400bp)，这是什么原因啊？
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每个人都有心底最柔软的地方，请不要触碰它，因为每个人都有自己的尊严！
4楼2014-05-01 09:38:47
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