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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 本人目前遇到连接问题
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JICK159

木虫 (正式写手)

[求助] 本人目前遇到连接问题 已有7人参与

本人目前遇到连接问题，载体为枯草pp43nmk 6800bp，基因约1600bp，连接后跑胶多为一万以上的条带，转化后一点都不长，怎么破
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1楼 2014-04-25 15:43:00
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
JICK159(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-25 18:50:15
连接以后不需要跑胶啊，直接转化，你这个情况应该就是一次就能连上的啊。你说说你是怎么做的吧

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2楼2014-04-25 17:28:42
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JICK159

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-04-25 17:28:42
连接以后不需要跑胶啊，直接转化，你这个情况应该就是一次就能连上的啊。你说说你是怎么做的吧

我连接后转化一直不长，我去跑胶试试，结果发现时一条大于一万条带
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3楼2014-04-25 18:13:48
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jonew

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你链接了多少？还跑胶？把所有的连接产物全部加进去转化，就出来了，另外，如果12h没有斑，就多长几天，，，，
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借口很贱，，，
4楼2014-04-25 18:15:38
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JICK159

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jonew at 2014-04-25 18:15:38
你链接了多少？还跑胶？把所有的连接产物全部加进去转化，就出来了，另外，如果12h没有斑，就多长几天，，，，

张不了，24小时也不长
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5楼2014-04-25 18:18:43
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jonew

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by JICK159 at 2014-04-25 18:18:43
张不了，24小时也不长...

再长一天
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借口很贱，，，
6楼2014-04-25 18:44:12
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JICK159

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by jonew at 2014-04-25 18:44:12
再长一天

我放了3天基本全是杂菌
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7楼2014-04-25 19:02:06
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zkz38210098

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你选的是那两个酶切位点。载体双酶切完全吗？
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8楼2014-04-27 09:41:29
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JICK159

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zkz38210098 at 2014-04-27 09:41:29
你选的是那两个酶切位点。载体双酶切完全吗？

应该完全，切后基本只有两条带，一条是原来就有的基因890bp，还有就是质粒6800bp，酶切是用buffer r pstI和hindIII
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9楼2014-04-27 12:17:55
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zkz38210098

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by JICK159 at 2014-04-27 12:17:55
应该完全，切后基本只有两条带，一条是原来就有的基因890bp，还有就是质粒6800bp，酶切是用buffer r pstI和hindIII...

你的连接体系是怎么样的？用什么公司的连接酶？按照说明书确定体系。载体跟目的片段的比例一般是1:3~9，注意是摩尔比不是体积比。还有检查下你的平板的抗性是否正确，我们以前有出现过质粒是氨苄抗性的转化涂板涂到卡那抗性平板上，结果当然什么都不长。也可以直接做个空载体转化涂板，确定你的平板没有问题。
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10楼2014-04-27 17:02:51
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