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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 本人目前遇到连接问题
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refreshing11

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
JICK159: 金币+10, ★有帮助 2014-04-28 10:07:16
酶切连接首先要确保割胶回收的产物的质量，然后严格按照连接试剂盒的要求操作，保证载体和目的片段的量符合试剂盒的要求，中间任何一个缓解出问题都会影响连接的，再转化时是，可以做一个没有切过的质粒作对照，这个对照要保证能长出斑来，再试试吧
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11楼2014-04-27 18:07:23
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raoreng
12楼2014-04-27 19:00:47
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393658000

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
JICK159: 金币+10, ★有帮助 2014-04-28 10:08:00
首先PstI是有星活性的，你虽然是显示切开了，但是会切坏，那样你肯定是连接不上去。如果可能的话你可以换个酶试试，或者先用O去切PstI,切好以后在纯化切HindIII试试。
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13楼2014-04-28 09:11:06
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JICK159

木虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by zkz38210098 at 2014-04-27 17:02:51
你的连接体系是怎么样的？用什么公司的连接酶？按照说明书确定体系。载体跟目的片段的比例一般是1:3~9，注意是摩尔比不是体积比。还有检查下你的平板的抗性是否正确，我们以前有出现过质粒是氨苄抗性的转化涂板涂到 ...

连接酶，takara和博彩的都试过了，结果一样，抗性是amp的，应该没问题，我其他都在做的，摩尔比我知道，1：1-1:6都试过了，没有用
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14楼2014-04-28 10:06:50
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JICK159

木虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by refreshing11 at 2014-04-27 18:07:23
酶切连接首先要确保割胶回收的产物的质量，然后严格按照连接试剂盒的要求操作，保证载体和目的片段的量符合试剂盒的要求，中间任何一个缓解出问题都会影响连接的，再转化时是，可以做一个没有切过的质粒作对照，这个 ...

我觉得环节应该没有问题，我做pet系统的基本都很成功
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15楼2014-04-28 10:07:43
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JICK159

木虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 393658000 at 2014-04-28 09:11:06
首先PstI是有星活性的，你虽然是显示切开了，但是会切坏，那样你肯定是连接不上去。如果可能的话你可以换个酶试试，或者先用O去切PstI,切好以后在纯化切HindIII试试。

我试试看吧，单切的
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16楼2014-04-28 10:08:15
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
也有可能是感受态细胞的问题
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rainwater
17楼2014-04-28 11:41:00
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zhanggg709

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

载体可能有问题，给载体测序看看。或从公司里买新的载体，或找刚刚做成功的实验室引进载体。
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18楼2014-04-29 04:40:21
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