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yushijiang30

新虫 (初入文坛)

[求助] 我酶切连接总是连不上去,连了很长时间的,恳请高手过来帮帮我已有11人参与

我目的基因500bp,载体11000多kb,酶切回收后,测的目的基因浓度35纳克/微升,载体78纳克/微升,我用过10微升体系连接,15微升体系连接,转化大肠杆菌总是长不出菌来,没有怀疑是平板或抗生素的问题,是不是我回收的的片段浓度太小,连接不上啊?图片是我回收完之后跑的电泳,目的基因和载体。
我酶切连接总是连不上去,连了很长时间的,恳请高手过来帮帮我
360软件小助手截图20140418145704.jpg
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鱼肠yu

新虫 (初入文坛)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-12 18:48:48
感受态有没有问题?如果没有的的话可以调节一下目的基因和载体的比例试试
2楼2014-04-18 15:32:29
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yushijiang30

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 鱼肠yu at 2014-04-18 15:32:29
感受态有没有问题?如果没有的的话可以调节一下目的基因和载体的比例试试

感受态是刚买的,应该没问题,你看看我的目的片段跑胶是不是有点暗啊,35纳克/微升少不少?
3楼2014-04-18 15:43:20
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周志惠

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
载体确定是11000多kb么?这是得有多大啊
4楼2014-04-19 08:18:21
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KEVIN_LOVE

木虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 周志惠 at 2014-04-19 08:18:21
载体确定是11000多kb么?这是得有多大啊

应该是bp吧
5楼2014-04-19 10:03:07
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yushijiang30

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 周志惠 at 2014-04-19 08:18:21
载体确定是11000多kb么?这是得有多大啊

是bp,写错了。
6楼2014-04-19 16:23:48
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永远不知道

至尊木虫 (著名写手)

金花家族创始人

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2014-04-19 17:25:56
毫无疑问,浓度不够,目的片段建议50以上,载体片段建议30以上,比例1:7左右,看看抗生素有无问题,还有感受态的特性,会不会是致死所致

[ 发自小木虫客户端 ]
7楼2014-04-19 16:43:55
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by 永远不知道 at 2014-04-19 16:43:55
毫无疑问,浓度不够,目的片段建议50以上,载体片段建议30以上,比例1:7左右,看看抗生素有无问题,还有感受态的特性,会不会是致死所致

比例是不是说的摩尔比?和体积比怎么换算过来?最近也一直在构建载体

[ 发自小木虫客户端 ]
天道酬勤
8楼2014-04-19 17:22:10
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yushijiang30

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 永远不知道 at 2014-04-19 16:43:55
毫无疑问,浓度不够,目的片段建议50以上,载体片段建议30以上,比例1:7左右,看看抗生素有无问题,还有感受态的特性,会不会是致死所致

你好,怎么回收的能到50的,我今天酶切了3管目的基因,50微升体系的,然后都加到一个过滤柱里,结果测出来的浓度才10几纳克每微升?
9楼2014-04-19 17:34:29
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allegory

禁虫 (著名写手)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-04-21 08:44:50
本帖内容被屏蔽

10楼2014-04-19 21:16:43
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