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emmaya新虫 (初入文坛)
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RED重组敲除基因，PCR验证时既有目的基因条带也有打靶片段条带已有4人参与
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如题，欲敲除的是大肠杆菌K-12的C600分子伴侣GroEL基因，大小约为1700bp。用RED重组方法，电转入两边各带50bp同源臂的线性片段（大小约1100bp）后，对筛选出来的疑似敲除菌株抽基因组PCR验证。 引物为目的基因5’、3’端，扩增出来的条带有两条，既有没敲掉的原基因大小，也有线性片段的条带。 在目的基因上游和线性片段中间设计的一对引物，则只有一条带，且大小正确，理论上来讲线性片段应该交换到基因组上了； 对目的基因非同源臂部分，设计了一对引物，疑似敲除的菌株与原始菌扩增出来的条带大小一样，说明目的基因还在。 想请教，这个情况到底是为什么呢，怎么会两种情况同时出现，不是应该要么线性片段交换上要么没有吗？ 不知道问题出在哪里，有没有大牛有相似的经历的，什么办法可以解决呢？求给点意见！ |
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i760912798
木虫 (正式写手)
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xn8008: 金币+1, 欢迎发帖提问 2016-08-06 12:52:41
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设计长引物扩增同源臂高保真酶还是普通taq酶扩增，同源臂还是有突变，有什么方法可以避免同源臂突变？ 发自小木虫Android客户端 |
14楼2016-03-25 06:14:11