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松松一号

木虫 (正式写手)

[求助] 基因片段测序的问题

放线菌的保守序列PCR用来鉴别物种，用的通用引物，目标16S片段理论上应该是1500 bp左右，PCR之后和marker对照也是在1500 bp左右，但是送去华大基因测序之后返回的结果只有1250 bp左右，测了两次都是这样，PCR产物是用割胶回收的方法纯化后送样测序的。这个问题可能是出在什么地方呢？谢谢。
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try try ! Day Day comfortable……
1楼 2014-03-10 14:13:36
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yingzan163

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
松松一号: 金币+10, 博学EPI+1, ★★★很有帮助 2014-04-04 10:54:29
有可能仍存在非特异性扩增，由于1500bp和1250bp差距不大，通过胶回收不一定能有效的将两者区分开。建议做TA克隆。另外做鉴别物种，通过比对即可，不一定非要1500bp啊。
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2楼2014-03-11 22:28:42
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松松一号

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yingzan163 at 2014-03-11 22:28:42
有可能仍存在非特异性扩增，由于1500bp和1250bp差距不大，通过胶回收不一定能有效的将两者区分开。建议做TA克隆。另外做鉴别物种，通过比对即可，不一定非要1500bp啊。

嗯，因为是鉴定细菌的保守序列，一般不会有这种非特异性扩增。现在想会不会是测序的问题？长度大于1000bp 一个反应测不通。 鉴别物种倒可以，就是上传序列到NCBI 时一直提示序列有问题。说是有嵌合体（chimera）的存在。
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3楼2014-03-12 09:29:32
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