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松松一号

木虫 (正式写手)

[求助] 基因片段测序的问题

放线菌的保守序列PCR用来鉴别物种,用的通用引物,目标16S片段理论上应该是1500 bp左右,PCR之后和marker对照也是在1500 bp左右,但是送去华大基因测序之后返回的结果只有1250 bp左右,测了两次都是这样,PCR产物是用割胶回收的方法纯化后送样测序的。这个问题可能是出在什么地方呢?谢谢。

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yingzan163

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
松松一号: 金币+10, 博学EPI+1, ★★★很有帮助 2014-04-04 10:54:29
有可能仍存在非特异性扩增,由于1500bp和1250bp差距不大,通过胶回收不一定能有效的将两者区分开。建议做TA克隆。另外做鉴别物种,通过比对即可,不一定非要1500bp啊。
2楼2014-03-11 22:28:42
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松松一号

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by yingzan163 at 2014-03-11 22:28:42
有可能仍存在非特异性扩增,由于1500bp和1250bp差距不大,通过胶回收不一定能有效的将两者区分开。建议做TA克隆。另外做鉴别物种,通过比对即可,不一定非要1500bp啊。

嗯,因为是鉴定细菌的保守序列,一般不会有这种非特异性扩增。现在想会不会是测序的问题?长度大于1000bp 一个反应测不通。 鉴别物种倒可以,就是上传序列到NCBI 时一直提示序列有问题。说是有嵌合体(chimera)的存在。
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3楼2014-03-12 09:29:32
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