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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 急！毕赤酵母电转后怎么用pcr方法鉴定重组成功？
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动力小火车

新虫 (初入文坛)

[求助] 急！毕赤酵母电转后怎么用pcr方法鉴定重组成功？已有3人参与

用电转的方法将线性化的包含目的基因的载体质粒导入GS115后，涂在用含有Zeocin的YPD，筛选出了阳性克隆。提取基因组DNA，用目的片段的特异引物pcr鉴定有目的片段的条带。但是进行甲醇诱导表达后，用SDS—PAGE检测没有诱导出目的蛋白。看protocal说用通用引物5‘AOX和3'AOX PCR 鉴定,如果PCR出两条带表示重组成功，可是同源重组后怎么能p出两条带呢？谁能给解释下呢？
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1楼2014-03-01 21:05:24
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

shxteacher

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-31 01:38:53
引用回帖:
5楼: Originally posted by 动力小火车 at 2014-03-02 22:06:13
谢谢，我是想知道如果用通用引物5‘AOX和3’AOX pcr的话，是什麽结果呢？有很人说是有两条带一条2200的AOX的条带，以及目的片段的条带。实在理解不了呀...

这个就得看你的毕赤酵母感受态细胞的类型。个人感觉，如果对于GS115，它本身的AOX1（663aa*3≈2000不怕，加上收尾其他碱基，差不多就是2200bp）基因没被敲除，2200bp的片段可能就是本身的AOX1；另外一个条带就是你的目的片段了。如果你试试KM71，KM71H感受态细胞，可能就没有2200bp的片段了。个人观点，仅供参考。呵呵
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OMG
8楼2014-03-03 01:32:17
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liu208xj

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
送红花一朵
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-03-31 01:39:01
1)特异性引物筛选有特异性条带，应该是整合进去了；
2）通用引物是有两条带的，一个是基因组本身的，一个是目的条带的，你也可以选一个5‘AOX或3'AOX为一个引物，另外一个从目的基因上选择进行筛选；
3）没有检测出目的蛋白存在多方面的原因：1）蛋白浓度；2）没有表达
4）没有表达的问题：启动子 CD序列 偏爱密码子
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9楼2014-03-05 10:46:40
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普通回帖

2014神虫浮云

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
silicare: 屏蔽内容, 违规存档 2014-03-02 15:19:28
本帖内容被屏蔽
2楼2014-03-01 22:52:14
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shxteacher

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 应助指数+1, 鼓励交流 2014-03-02 10:45:59
出现两条带，如果都比较亮的话，那么有可能在同一个基因组中出现了2个拷贝。
本想你想的是-A-，而双拷贝-A-A-，看你2个电泳条带之间的距离差距，可以判定它们的插入距离。
如果SDS-PAGE没有看见目的蛋白，建议你浓缩一下，再跑蛋白胶看看
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OMG
3楼2014-03-02 00:18:38
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hxswdl

至尊木虫 (文坛精英)

Tortoise

文献杰出贡献
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
筛选阳性克隆之后不需要再筛选多拷贝的么？？？pcr不能直接菌P么，同样做毕赤酵母的来学下知识
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Dripping Concentrated!!energetic and active！
4楼2014-03-02 09:04:38
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动力小火车

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by shxteacher at 2014-03-02 00:18:38
出现两条带，如果都比较亮的话，那么有可能在同一个基因组中出现了2个拷贝。
本想你想的是-A-，而双拷贝-A-A-，看你2个电泳条带之间的距离差距，可以判定它们的插入距离。
如果SDS-PAGE没有看见目的蛋白，建议你浓 ...

谢谢，我是想知道如果用通用引物5‘AOX和3’AOX pcr的话，是什麽结果呢？有很人说是有两条带一条2200的AOX的条带，以及目的片段的条带。实在理解不了呀
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5楼2014-03-02 22:06:13
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动力小火车

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by hxswdl at 2014-03-02 09:04:38
筛选阳性克隆之后不需要再筛选多拷贝的么？？？pcr不能直接菌P么，同样做毕赤酵母的来学下知识

因为筛的阳性克隆一共就3个，所以也就没法筛多拷贝了。。p菌的话，假阴性比例太高了。
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6楼2014-03-02 22:07:38
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水墨蓝

铁虫 (小有名气)
我记得我当时是用组氨酸缺陷平板筛的阳性克隆 然后挑单菌落到96孔板，用G418梯度筛 楼主可以考虑下
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7楼2014-03-02 22:36:10
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liyu0355

木虫 (正式写手)
如果筛选Mut+整合，可见两条带，一条与目的基因相关，另一条为AOX1 基因（大
约2.2kb），如果筛选GS115 中Muts整合，可见与目的基因相关的一条带。在KM71 中，由
于ARG4 插入AOX1，PCR 产物为3.6kb。亲代质粒产生下列大小PCR 产物。在分析PCR
结果时，需将这些片段的长度加到最终片段中。

重要：如使用α-factor 引物，在GS115 及KM71 中都可见一条带。因为染色体AOX1
基因上没有α-factor信号序列。
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10楼2014-05-05 10:26:59
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