应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 连接时载体去磷
51/1返回列表
查看: 2597  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

zhang宇微

金虫 (正式写手)

[求助] 连接时载体去磷 已有3人参与

载体和目的片段链接的时候，因为载体自连，阳性很少，所以用碱性磷酸酶处理载体去磷，再和目的片段连接，以提高连接效率。
我想问一下，去磷的反应条件是什么，然后怎么把载体上的磷酸酶去掉终止反应，80度反应20分钟会不会让DNA双链开环，还有没有其他方法？连接时目的片段怎么处理？PCR回收后就可以用T4连接酶连了吗？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-02-19 16:58:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shiyiyaya

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-20 00:04:32
zhang宇微: 金币+3 2014-03-06 20:08:43
zhang宇微: 金币+3, ★有帮助 2014-04-24 13:31:40
zhang宇微: 金币+3, ★有帮助 2014-04-28 16:31:21
我们去磷的时候用SAP，小牛磷酸酶等，他们都有对应的buffer，也是按照说明书做的。灭活的时候65°C即可，20min。

直接胶回收，回收柱的那种简单回收，去掉盐离子就行。后续连接正常。

祝顺利！
赞一下 回复此楼
4楼2014-02-19 17:45:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhang宇微: 金币+3 2014-03-06 20:08:28
zhang宇微: 金币+3, ★有帮助 2014-04-24 13:30:53
去磷酸化的条件严格按照你所使用的去磷酸化的说明书来，不同的去磷酸酶反应条件不一样，不同公司的酶也略有不同，但每种酶每个公司都会有自己的产品说明书和使用说明书

你要先做去磷酸化处理，你是单酶切载体的吗？如果是双酶切的话，就用不着去磷酸化

目的片段PCR回收后，要看你连什么载体，如果是连目标载体，你的片段需要用你设计的相关限制性内切酶进行酶切然后和载体进行连接
赞一下(1人) 回复此楼
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2014-02-19 17:27:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-20 00:05:09
一般来说，载体去磷酸化不好掌握。如果不用尽量不用。
http://www.51atgc.com/shiyanjish ... 0-01-17/1226_2.html
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2014-02-19 17:28:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

XOooZzz

银虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-20 00:04:40
zhang宇微: 回帖置顶 2014-04-24 13:32:08
同意ls各位。
我是这样做的：用thermo的快酶酶切，同时往酶切体系（20 uL）中加入takara的CIP 0.5～1 uL，反应1小时，80度灭活10 min。跑胶回收。
也许不太严谨，但反正做起来没问题。
赞一下(1人) 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

zhang宇微
5楼2014-02-19 20:13:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 申请科研项目纯靠实力能成功吗？ 200+5 David1982 2026-10-13 9/450 2026-10-15 08:34 by dypengfei
[硕博家园] 极限拉扯，如何抉择 +11 Isak0320 2026-10-12 15/750 2026-10-14 21:55 by 猫鱼不是鱼
[硕博家园] 中科院海洋所招收海洋材料相关领域博士研究生及研究助理 +3 sujiner 2026-10-08 4/200 2026-10-14 20:40 by qicaiyun
[论文投稿] 二审4个多月了还是Awaiting Reviewer Scores 10+3 纳斯达克ML 2026-10-11 4/200 2026-10-14 17:30 by babero
[有机交流] OpenAI又攻克数学难题了，离AI做有机合成还有多远？ +8 wangyl_123 2026-10-10 13/650 2026-10-14 15:12 by zuesli
[基金申请] 入职后第一次管课题组的专利缴费，对账才发现官费比别人多掏了一倍 +6 13108017953 2026-10-08 6/300 2026-10-12 20:07 by w3w3y3
[公派出国] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 9/450 2026-10-11 22:34 by XQNyDCa1Tk5n
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 10/500 2026-10-11 22:26 by XQNyDCa1Tk5n
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 9/450 2026-10-11 22:15 by XQNyDCa1Tk5n
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 22:11 by XQNyDCa1Tk5n
[教师之家] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 (EPI+-1)(金币-50) +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 10/500 2026-10-11 22:06 by XQNyDCa1Tk5n
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 (EPI+-1)(金币-50) +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 10/500 2026-10-11 14:25 by VOMexwnDzOFZ
[教师之家] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 (EPI+-1)(金币-50) +4 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 14:05 by VOMexwnDzOFZ
[考研] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 8/400 2026-10-11 13:51 by VOMexwnDzOFZ
[硕博家园] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 8/400 2026-10-11 13:45 by VOMexwnDzOFZ
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +4 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 10:34 by VOMexwnDzOFZ
[考博] 招收博士生一名 +3 mandolin 2026-10-10 3/150 2026-10-11 10:21 by 不是山谷！
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 4/200 2026-10-11 03:14 by M0zrYVSAnxpE
[有机交流] 各位大佬，路线设计求助 +6 zapen 2026-10-08 8/400 2026-10-10 15:59 by zapen
[有机交流] 我应该选哪条合成路线让实验成功率高一些？ +5 jing816y 2026-10-08 9/450 2026-10-10 09:05 by zapen
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭