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zhang宇微

金虫 (正式写手)

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[求助] 连接时载体去磷已有3人参与

载体和目的片段链接的时候，因为载体自连，阳性很少，所以用碱性磷酸酶处理载体去磷，再和目的片段连接，以提高连接效率。
我想问一下，去磷的反应条件是什么，然后怎么把载体上的磷酸酶去掉终止反应，80度反应20分钟会不会让DNA双链开环，还有没有其他方法？连接时目的片段怎么处理？PCR回收后就可以用T4连接酶连了吗？

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1楼 2014-02-19 16:58:55

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shiyiyaya

金虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-20 00:04:32
zhang宇微: 金币+3 2014-03-06 20:08:43
zhang宇微: 金币+3, ★有帮助 2014-04-24 13:31:40
zhang宇微: 金币+3, ★有帮助 2014-04-28 16:31:21

我们去磷的时候用SAP，小牛磷酸酶等，他们都有对应的buffer，也是按照说明书做的。灭活的时候65°C即可，20min。

直接胶回收，回收柱的那种简单回收，去掉盐离子就行。后续连接正常。

祝顺利！

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4楼2014-02-19 17:45:39

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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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【答案】应助回帖

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zhang宇微: 金币+3 2014-03-06 20:08:28
zhang宇微: 金币+3, ★有帮助 2014-04-24 13:30:53

去磷酸化的条件严格按照你所使用的去磷酸化的说明书来，不同的去磷酸酶反应条件不一样，不同公司的酶也略有不同，但每种酶每个公司都会有自己的产品说明书和使用说明书

你要先做去磷酸化处理，你是单酶切载体的吗？如果是双酶切的话，就用不着去磷酸化

目的片段PCR回收后，要看你连什么载体，如果是连目标载体，你的片段需要用你设计的相关限制性内切酶进行酶切然后和载体进行连接

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