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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 连接时载体去磷
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zhang宇微

金虫 (正式写手)

[求助] 连接时载体去磷 已有3人参与

载体和目的片段链接的时候，因为载体自连，阳性很少，所以用碱性磷酸酶处理载体去磷，再和目的片段连接，以提高连接效率。
我想问一下，去磷的反应条件是什么，然后怎么把载体上的磷酸酶去掉终止反应，80度反应20分钟会不会让DNA双链开环，还有没有其他方法？连接时目的片段怎么处理？PCR回收后就可以用T4连接酶连了吗？
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1楼 2014-02-19 16:58:55
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回帖置顶 ( 共有1个 )

XOooZzz

银虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-20 00:04:40
zhang宇微: 回帖置顶 2014-04-24 13:32:08
同意ls各位。
我是这样做的：用thermo的快酶酶切，同时往酶切体系（20 uL）中加入takara的CIP 0.5～1 uL，反应1小时，80度灭活10 min。跑胶回收。
也许不太严谨，但反正做起来没问题。
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zhang宇微
5楼2014-02-19 20:13:59
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhang宇微: 金币+3 2014-03-06 20:08:28
zhang宇微: 金币+3, ★有帮助 2014-04-24 13:30:53
去磷酸化的条件严格按照你所使用的去磷酸化的说明书来，不同的去磷酸酶反应条件不一样，不同公司的酶也略有不同，但每种酶每个公司都会有自己的产品说明书和使用说明书

你要先做去磷酸化处理，你是单酶切载体的吗？如果是双酶切的话，就用不着去磷酸化

目的片段PCR回收后，要看你连什么载体，如果是连目标载体，你的片段需要用你设计的相关限制性内切酶进行酶切然后和载体进行连接
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2014-02-19 17:27:42
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-20 00:05:09
一般来说，载体去磷酸化不好掌握。如果不用尽量不用。
http://www.51atgc.com/shiyanjish ... 0-01-17/1226_2.html
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3楼2014-02-19 17:28:15
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普通回帖

shiyiyaya

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-20 00:04:32
zhang宇微: 金币+3 2014-03-06 20:08:43
zhang宇微: 金币+3, ★有帮助 2014-04-24 13:31:40
zhang宇微: 金币+3, ★有帮助 2014-04-28 16:31:21
我们去磷的时候用SAP，小牛磷酸酶等，他们都有对应的buffer，也是按照说明书做的。灭活的时候65°C即可，20min。

直接胶回收，回收柱的那种简单回收，去掉盐离子就行。后续连接正常。

祝顺利！
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4楼2014-02-19 17:45:39
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zhang宇微

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-19 20:13:59
同意ls各位。
我是这样做的：用thermo的快酶酶切，同时往酶切体系（20 uL）中加入takara的CIP 0.5～1 uL，反应1小时，80度灭活10 min。跑胶回收。
也许不太严谨，但反正做起来没问题。

我也是这样的
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6楼2014-04-24 13:32:00
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zhang宇微

金虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-19 20:13:59
同意ls各位。
我是这样做的：用thermo的快酶酶切，同时往酶切体系（20 uL）中加入takara的CIP 0.5～1 uL，反应1小时，80度灭活10 min。跑胶回收。
也许不太严谨，但反正做起来没问题。

7楼2014-04-24 13:32:42
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jiajiav1991

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by shiyiyaya at 2014-02-19 17:45:39
我们去磷的时候用SAP，小牛磷酸酶等，他们都有对应的buffer，也是按照说明书做的。灭活的时候65°C即可，20min。

直接胶回收，回收柱的那种简单回收，去掉盐离子就行。后续连接正常。

祝顺利！

跑胶回收的效率比用酚抽提的要高是吗？
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我不想站得多高，看得多远，只想做好手上的每一件事。
8楼2014-06-01 21:42:20
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
zhang宇微: 金币+1 2014-09-05 13:07:43
zhang宇微: 金币+4 2014-09-05 13:08:28
引用回帖:
8楼: Originally posted by jiajiav1991 at 2014-06-01 21:42:20
跑胶回收的效率比用酚抽提的要高是吗？...

割胶回收效率肯定低于酚仿抽提，但是杂质去除的比较彻底，比较纯
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大家相互帮助哈
9楼2014-06-02 01:48:41
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jiajiav1991

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-02 01:48:41
割胶回收效率肯定低于酚仿抽提，但是杂质去除的比较彻底，比较纯...

谢谢，那去磷酸化之前酶切过的载体大片段是否需要纯化一下？
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我不想站得多高，看得多远，只想做好手上的每一件事。
10楼2014-06-02 12:21:05
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