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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物信息 » 质粒测序无信号，为啥？
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henghengyouyou

银虫 (正式写手)

[求助] 质粒测序无信号，为啥？ 已有3人参与

各位，最近我做了PCR产物纯化，加A，连接TA vector,挑单克隆，提取质粒准备送去测序。
单克隆菌液PCR都为阳性，抽提质粒后也表明重组质粒要比空载质粒大很多，应该是片段克隆进入载体了。
但是为啥我用引物测序无信号呢，包括通用引物和克隆引物？什么情况？
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1楼 2014-02-13 06:20:27
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wangdunzju

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
137167741: 金币+2, 小木虫交流，共同进步~~ 2014-02-15 10:36:22
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-03-30 00:22:06
可以从两个方面分析;
第一种情况：PCR产物不纯，连入载体的不是目的序列，这需要你用通用引物和特异引物分别PCR检测可以判断是不是这种情况。检测最好用菌液PCR，不用菌斑PCR。

第二种情况：插入片段是你的目的片段，但后期出问题了，比如，摇菌的菌株有污染，（如培养基污染了别人的菌，也有抗性）。再或者摇菌的浓度太稀，也测不出来，这可能是测序那边的问题。还有你的载体是不是用对了，要是这个都搞错了，估计也会遇到类似问题出现。
祝好运！
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2楼2014-02-13 10:32:28
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wangdunzju

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
henghengyouyou: 金币+1 2014-02-13 22:12:50
137167741: 金币+1, 鼓励交流~~ 2014-02-15 10:36:35
另外，载体的质量也很关键，TAKARA或者英骏的T载体都还好。
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3楼2014-02-13 10:34:30
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2014-02-15 10:36:44
测序无信号，你通用引物最起码会出现载体片段序列。可能你送的样品有问题。会不会送错了。你再重新提一次质粒测一下序。
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hehe
4楼2014-02-13 10:44:32
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henghengyouyou

银虫 (正式写手)
★
137167741: 金币+1, 鼓励交流~~ 2014-02-15 10:36:58
引用回帖:
3楼: Originally posted by wangdunzju at 2014-02-13 10:34:30
另外，载体的质量也很关键，TAKARA或者英骏的T载体都还好。

说实话，载体是10年前的了，偶尔好用，偶尔不好用。郁闷！
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5楼2014-02-13 22:13:31
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mao081312

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-30 00:22:21
空质粒和重组质粒都是多大呢？通用引物都没有测序信号，说明肯定不会是你有没有连上这个问题，而是你质粒的问题，你可以把你的空质粒送去测序，看质粒上是否有相应的序列
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6楼2014-02-15 11:37:49
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