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yzliuxi

银虫 (初入文坛)

[求助] 从氨基酸序列到基因克隆 已有5人参与

求助各位高人,本人对分子一无所知,不料却被领导要求写东西,被搞得晕头转向,文献也看不明白。
    我的设想是分离出的一种肽类活性物质,通过edman降解获得氨基酸序列,然后怎么样通过获得的氨基酸序列得到这种物质的基因呢(假设搜索不到什么同源序列之类的)?具体采取什么技术方法?
    我只大概的知道要设计引物,用RACE获得全长。其余的具体怎么描述啊?
    拜托大家帮帮忙。。。。

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RXMCDM

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【答案】应助回帖

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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-02-07 12:55:48
yzliuxi: 金币+10, 有帮助 2014-02-07 23:27:00
通过edman降解获得氨基酸序列,通过获得的氨基酸序列得到这种物质基因编码区,加非编码区、内含子等得到这种物质的基因。其他的可以请生物公司帮你做了。
2楼2014-02-07 02:05:00
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-02-07 12:55:57
yzliuxi: 金币+20, 有帮助 2014-02-07 23:27:31
如果不对目标蛋白的基因进行研究,只要得到表达蛋白的基因,可以人工合成基因。如果要克隆到原基因,可以考虑根据测到的蛋白序列设计简并引物,对Oligo(dT)反转录的cDNA文库进行PCR扩增。根据提取的蛋白大小估计PCR扩增片段的大小,测序鉴定。

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为什么
3楼2014-02-07 10:31:31
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yzliuxi

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 547star at 2014-02-07 10:31:31
如果不对目标蛋白的基因进行研究,只要得到表达蛋白的基因,可以人工合成基因。如果要克隆到原基因,可以考虑根据测到的蛋白序列设计简并引物,对Oligo(dT)反转录的cDNA文库进行PCR扩增。根据提取的蛋白大小估计PCR ...

你看一下我这样的描述对不对。我这多肽是从一生物中分离出来的。
    先提取该生物的总RNA,反转录成cDNA。
    根据edman降解获得的氨基酸序列设计兼并引物,以反转录得到的cDNA为模板进行pcr扩增获得目的基因的cDNA序列。
    问题是,这样pcr获得的是不是序列的全长?
怎么鉴定获得的cDNA序列?

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4楼2014-02-07 15:59:33
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050605044

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

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找到转录RNA,反转录!
食品
5楼2014-02-07 16:33:43
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baihaer

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-03-30 00:03:14
在NCBI里用你测得的氨基酸序列找到对应的基因和其mRNA序列,然后设计引物用cDNA文库克隆出你的目的基因
没有SB的事,只有SB的人
6楼2014-02-07 21:57:50
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547star

木虫 (著名写手)

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-03-30 00:03:25
引用回帖:
4楼: Originally posted by yzliuxi at 2014-02-07 15:59:33
你看一下我这样的描述对不对。我这多肽是从一生物中分离出来的。
    先提取该生物的总RNA,反转录成cDNA。
    根据edman降解获得的氨基酸序列设计兼并引物,以反转录得到的cDNA为模板进行pcr扩增获得目的基因的 ...

PCR产物双向测通,如果下游有poly(A)尾巴就更好,即使没有寻找读码框,就基本得到比较完整的基因了,再翻译成氨基酸序列。你分离的多肽可以用质谱得到比较多的氨基酸序列信息。再比较氨基酸序列,可以进一步判断。如果结合NCBI的Genbank的相似核酸序列和蛋白质序列,可以帮助判断序列的结构。
为什么
7楼2014-02-08 18:22:22
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qiaozheng1

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
现在到公司,直接测序列就行了,不要你操心的,例如生工

[ 发自小木虫客户端 ]
8楼2014-02-08 18:57:21
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