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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 单酶切后的载体和目的片段是否都需要去磷酸化
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薄荷zwz

新虫 (小有名气)

[求助] 单酶切后的载体和目的片段是否都需要去磷酸化 已有3人参与

我的载体是9400   目的片段1800，都是用BglII进行的单酶切，在连接之前是否需要对两个都去磷酸化，我刚开始只对载体的5端用热激磷酸酶去磷酸化，没有对目的片段去磷酸化，目的片段会自连吗？
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1楼 2014-01-20 18:59:20
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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gyesang: 金币+5, 鼓励交流！ 2014-01-26 06:21:42
要知道两个去掉5'-P的片段是无法连接的，所以你只需要把载体片段去磷酸化，而目的片段不能去，去了没有办法反应。因为通常筛选marker是在载体片段上的，对载体片段去磷酸化是为了避免筛选板上长很多空载体自连的克隆，通常用于单酶切后的连接克隆。目的片段上通常没有筛选marker，即使自连也无法在筛选平板上长出克隆的。如果你的目的片段上有与载体片段不同的筛选marker，当用双筛选标记时载体去不去磷酸化都无所谓的。
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5楼2014-01-21 02:50:47
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-01-21 09:28:46
载体去磷酸化，片段没必要。但这个技术我没掌握，汗颜啊，做了2个月没做出来，换了个方法，祝成功。
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2楼2014-01-20 21:08:47
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-01-21 09:28:50
载体去磷酸化就可以，连接片段不用。还需要目的片段上的磷酸基团连接载体。目的片段部分会自连但转化不会生长。
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hehe
3楼2014-01-20 21:46:42
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kehan777

木虫 (小有名气)
你的目的片段单酶切？那有一个黏性末端和一个平末端咯？
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4楼2014-01-20 22:01:57
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