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a83875785

铁杆木虫 (著名写手)

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[交流] 用的pCDNA-5重组质粒，通过测序检验质粒+目的基因是否构建成功已有2人参与

用的pCDNA-5重组质粒，通过测序检验质粒+目的基因是否构建成功,测序结果显示测序后的碱基序列是99%配对，氨基酸序列也是99%配对，用的是NCBI上的配对分析，请问这样能判断我的测序结果是我原来的目的基因吗？

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1楼 2014-01-10 16:32:22

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测质粒得到的序列比测PCR产物得到的序列信息更全，准确度更高，原因如下：
1.一个测序反应一般可以测出的序列长度有800bp左右，但是有一点要注意，从引物3'的位置以后约80bp的序列信息时测不出来的（可信度很低），这就导致你测PCR产物的话无法得到完整的序列信息，而测质粒，引物一般会从载体上选择来测目的片段的首尾序列，所以能够测出完整的序列信息
2.PCR产物通过连接转化整合到载体上并在受体菌中扩增，每一个步骤都有一定概率的引起某个或某几个碱基的突变，特别是当片段内有大量串联重复片段的话在个别受体菌内是容易被剪切和修改的，因此通过PCR产物测出的结果与测质粒得到的结果并不完全一样。
综上，测重组质粒得到的结果更可信！