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求高手帮助，关于定点突变引物设计
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我想设计某个位点的定点突变引物，但是由于序列的GC含量很高，所以引物自身二聚体和发夹结构很多，自由能最高的为-6.8，我想请问有没有办法可以解决这个问题，因为序列无法变，所以真的没办法了 还有点突变的引物一定要在30个碱基左右么，Tm值真的太高了 请各位高手一定帮帮忙，万分感谢！！！ 因为是第一次做这方面的，所以我想请问下，如果不用试剂盒，那么需要哪些试剂，步骤大概是什么？ 之前看一些点突变试剂盒的说明书，要求不一样，所以如果我不用试剂盒那么引物的设计依据是怎样的呢？ 点突变的 碱基位置均在上下游引物的中间么，还是一条在中间，另一条在最末端？ 举个例子，之前看到过两种情况 1.cgagcagtagGtagcgatagtt 2. GCGGCTCGTG CCGCCGgCCGTCGCCGA gctcgtcatcCatcgctatcaa AGCCCGACCG CGCCGAGCAC GGCGGCc 到底哪种是可行的呢？ 还有还有，很多都说Tm要大于78，这么高的退火温度可怎么进行延伸啊，能p成功么，还是说这是试剂盒要求的，不用试剂盒就不能使Tm过高？ |
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厉娜
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