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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 做细菌的双重荧光pcr
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a3200649

铜虫 (正式写手)

[求助] 做细菌的双重荧光pcr 已有1人参与

请问做2种细菌的双重荧光pcr，我用的是菌种，必须要制备标准品吗（进行PCR扩增，并将目的片段克隆于pMD18-T，
构建重组质粒，提取质粒进行PCR分析和测序验证）？必须要这一步吗？

如果不制备标准品，直接提取菌种DNA，然后并利用OD260nm/OD280nm比值来确定DNA的纯度，然后进行梯度稀释，测检测限，这样可以吗？
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1楼 2014-01-02 09:14:51
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by a3200649 at 2014-01-02 09:40:23
我说的已知需要检测的菌种可不可以算是标准品呢？...

如果该菌株是公认的含有这段序列，而你又是用公认的引探来检测，才算得上是阳性对照。否则别人可能怀疑你设计的引探是否适合。
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5楼2014-01-02 10:28:28
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sxxuan

金虫 (著名写手)
如果引探是能用的，最好还是拿公认的那种引探来做个对比，以证明效果。
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6楼2014-01-02 10:30:21
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sxxuan

金虫 (著名写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-01-02 13:36:13
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7楼: Originally posted by a3200649 at 2014-01-02 10:38:56
谢谢，再请教你3个问题，1.我用荧光pcr设计的引探中的引物来作为标准品前期的pcr扩增的引物是不是不可以啊（听老师说是荧光pcr的引物扩增出来的DNA要比普通的引物pcr的要短） 需要从新设计一段普通pcr的引物
2.这 ...

1. 荧光pcr的扩增长度最好控制在80-150bp，这样效果最好，所以引探的设计都是在特定基因的某个区域而并非全长。因此用荧光pcr的上下游引物来扩增并不一定能得到目的基因。
2. 如果是做克隆例如质粒做标准品，光从PCR扩增，不计算设计引物和合成的时间，大概需要一周。
3. 如果文献中的基因是你要做的，序列也是完全一样的，或者是这段序列涵盖了你的荧光引探区域，可以直接用文献中的引物序列。
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a3200649
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8楼2014-01-02 10:46:01
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by a3200649 at 2014-01-03 10:01:59
你好，再次麻烦你，想请教下，为什么外国文献关于做细菌的多重rt-pcr检测时，都没有做标准品呢？...

那外文用什么作为对照？
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13楼2014-01-03 11:58:45
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sxxuan

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
a3200649: 金币+20, ★★★★★最佳答案 2014-01-02 09:37:52
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2014-01-02 13:36:02
看看你的目的是什么，如果只是看看荧光的，有没有标准品都无所谓。但是涉及到发文章论文之类的，没有标准品谁确定你检测出的荧光就是你说的哪个？起码有个对照。
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2楼2014-01-02 09:30:51
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a3200649

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sxxuan at 2014-01-02 09:30:51
看看你的目的是什么，如果只是看看荧光的，有没有标准品都无所谓。但是涉及到发文章论文之类的，没有标准品谁确定你检测出的荧光就是你说的哪个？起码有个对照。

明白！谢谢
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3楼2014-01-02 09:37:42
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a3200649

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sxxuan at 2014-01-02 09:30:51
看看你的目的是什么，如果只是看看荧光的，有没有标准品都无所谓。但是涉及到发文章论文之类的，没有标准品谁确定你检测出的荧光就是你说的哪个？起码有个对照。

我说的已知需要检测的菌种可不可以算是标准品呢？
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4楼2014-01-02 09:40:23
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a3200649

铜虫 (正式写手)
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6楼: Originally posted by sxxuan at 2014-01-02 10:30:21
如果引探是能用的，最好还是拿公认的那种引探来做个对比，以证明效果。

谢谢，再请教你3个问题，1.我用荧光pcr设计的引探中的引物来作为标准品前期的pcr扩增的引物是不是不可以啊（听老师说是荧光pcr的引物扩增出来的DNA要比普通的引物pcr的要短） 需要从新设计一段普通pcr的引物
2.这个实验阳性标准品大约需要多少时间做的完啊（从扩增，到测序得到标准品）？我是新手，不太会！
3.我可不可以用其他文献的针对细菌某特异性基因的引物（例如 李斯特菌的hly特异性基因）来设计作为我该细菌普通pcr的引物呢？
谢谢
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7楼2014-01-02 10:38:56
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a3200649

铜虫 (正式写手)
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8楼: Originally posted by sxxuan at 2014-01-02 10:46:01
1. 荧光pcr的扩增长度最好控制在80-150bp，这样效果最好，所以引探的设计都是在特定基因的某个区域而并非全长。因此用荧光pcr的上下游引物来扩增并不一定能得到目的基因。
2. 如果是做克隆例如质粒做标准品，光从 ...

喔喔，明白了，我现在没有普通pcr的引物，只有荧光pcr的引探（国外文献上的），那我可以先做后面的荧光pcr检测，看看曲线？（那如果我这样做了，如果有曲线，那不是什么标准品就不用做了） 曲线出来了，我也可以作为的实验数据吧？
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9楼2014-01-02 11:05:26
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sxxuan

金虫 (著名写手)
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9楼: Originally posted by a3200649 at 2014-01-02 11:05:26
喔喔，明白了，我现在没有普通pcr的引物，只有荧光pcr的引探（国外文献上的），那我可以先做后面的荧光pcr检测，看看曲线？（那如果我这样做了，如果有曲线，那不是什么标准品就不用做了） 曲线出来了，我也可以作 ...

如果可以，最好还是做阳性对照。
不过荧光定量检测后可以把PCR产物送测序以证明检测结果是正确的。
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a3200649
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10楼2014-01-02 13:45:36
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