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a3200649

铜虫 (正式写手)

[求助] 做细菌的双重荧光pcr 已有1人参与

请问做2种细菌的双重荧光pcr,我用的是菌种,必须要制备标准品吗(进行PCR扩增,并将目的片段克隆于pMD18-T,
构建重组质粒,提取质粒进行PCR分析和测序验证)?必须要这一步吗?

如果不制备标准品,直接提取菌种DNA,然后并利用OD260nm/OD280nm比值来确定DNA的纯度,然后进行梯度稀释,测检测限,这样可以吗?
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sxxuan

金虫 (著名写手)

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2014-01-02 13:36:13
引用回帖:
7楼: Originally posted by a3200649 at 2014-01-02 10:38:56
谢谢,再请教你3个问题,1.我用荧光pcr设计的引探中的引物来作为标准品前期的pcr扩增的引物是不是不可以啊(听老师说是荧光pcr的引物扩增出来的DNA要比普通的引物pcr的要短) 需要从新设计一段普通pcr的引物
2.这 ...

1. 荧光pcr的扩增长度最好控制在80-150bp,这样效果最好,所以引探的设计都是在特定基因的某个区域而并非全长。因此用荧光pcr的上下游引物来扩增并不一定能得到目的基因。
2. 如果是做克隆例如质粒做标准品,光从PCR扩增,不计算设计引物和合成的时间,大概需要一周。
3. 如果文献中的基因是你要做的,序列也是完全一样的,或者是这段序列涵盖了你的荧光引探区域,可以直接用文献中的引物序列。

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你的日子如何,你的力量也必如何!
8楼2014-01-02 10:46:01
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sxxuan

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
a3200649: 金币+20, ★★★★★最佳答案 2014-01-02 09:37:52
gyesang: 金币+1, 鼓励交流! 2014-01-02 13:36:02
看看你的目的是什么,如果只是看看荧光的,有没有标准品都无所谓。但是涉及到发文章论文之类的,没有标准品谁确定你检测出的荧光就是你说的哪个?起码有个对照。
你的日子如何,你的力量也必如何!
2楼2014-01-02 09:30:51
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a3200649

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by sxxuan at 2014-01-02 09:30:51
看看你的目的是什么,如果只是看看荧光的,有没有标准品都无所谓。但是涉及到发文章论文之类的,没有标准品谁确定你检测出的荧光就是你说的哪个?起码有个对照。

明白!谢谢
希望大家多多交流
3楼2014-01-02 09:37:42
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a3200649

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by sxxuan at 2014-01-02 09:30:51
看看你的目的是什么,如果只是看看荧光的,有没有标准品都无所谓。但是涉及到发文章论文之类的,没有标准品谁确定你检测出的荧光就是你说的哪个?起码有个对照。

我说的已知需要检测的菌种可不可以算是标准品呢?
希望大家多多交流
4楼2014-01-02 09:40:23
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