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飘雪3889

木虫 (小有名气)

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[求助] RT-PCR反应中模板DNA的问题已有1人参与

我做RT-PCR，买的是Introvigen的试剂盒进行总RNA提取、逆转录成cDNA第一链、再PCR。以cDNA第一链作为模板进行PCR。今天有人指出，PCR是要用双链DNA为模板，而cDNA是单链，以单链为模板弄是错误的。而我看书上说RT-PCR是传统PCR的拓展，就是以cDNAA第一链作为模板的，合成第二链的过程实际已经包含在PCR过程中了，并且很多论文做RT-PCR的也是直接以cDNA第一链作为模板。请问下大家，我这样理解是不是对的？另外想到一个问题，以cDNA第一链作为模板进行PCR和以DNA双链为模板进行PCR，两种PCR试剂盒有没有区别，主要区别有哪些？谢谢大家了

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1楼 2013-12-21 15:30:37

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cicelyzh

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【答案】应助回帖

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飘雪3889: 金币+10, ★★★很有帮助, 我前些天已经明白了，不过还是要感谢您 2013-12-24 16:28:23

以单链cDNA为模板做PCR没有问题，和双链DNA模板的区别是在反应第一个循环时，只有一条引物（与cDNA互补的那条）发生反应。第一个循环过后就生成了两条互补的DNA链，接下来的过程就是完全相同的了。做RT-PCR都是用单链cDNA直接P的。我不知道你说的PCR试剂盒是什么。反转率的试剂盒通常也只能合成第一条cDNA链，如果要获取双链cDNA，通常是把RNA模板消化掉后在进行PCR获得。通常用于PCR的盒子无外乎包括buffer, Mg2+, dNTP，酶，这些都是普通PCR反应所必需的，应该没有太大区别。如果要做荧光定量，还有荧光染料。

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