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Tporker

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[求助] 毕赤酵母表达实验设计已有1人参与

欲进行毕赤酵母表达一个真核蛋白，实验设计如下：
合成基因：两端采用EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点双酶切连接进入pPIC9K中。
提取pPIC9K-目的基因，SacⅠ线性化后电转化进入GS115，MD平板筛选。
将MD平板的菌落进行过夜培养，粗提取基因组，进行基因组PCR（5‘AOX/3’AOX）鉴定阳性菌落。
将鉴定的阳性克隆，挑取在BMGY培养基中过夜，收集菌体，转入BMMY中进行诱导表达，取不同时间点的上清和菌体进行SDS-PAGE，查看是否能够诱导表达成功。
不知道这个大概思路怎么样？按照这个大致步骤做下来不知道可不可行？

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1楼 2013-12-16 15:44:28

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gyesang

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基本就是你写的这些，可行

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2楼2013-12-16 22:00:34

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2楼: Originally posted by gyesang at 2013-12-16 22:00:34
基本就是你写的这些，可行

好的，谢谢

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3楼2013-12-17 09:32:16

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2楼: Originally posted by gyesang at 2013-12-16 22:00:34
基本就是你写的这些，可行

请问在进行基因组PCR（5‘AOX/3’AOX）鉴定阳性菌落时候，PCR反应体系设计是否像普通PCR一样模板添加量为整个体系的1/20甚至更少？还是需要多加一点基因组？
体系：
Taq Buffer（含Mg+）    1.5
3AOX                            0.5
5AOX                            0.5
Taq                               0.3
dNTPs                            0.5
基因组                            0.3
H2O                               12
总                                  15
不知道是不是基因组少了？进行了几次都没有条带。Mut+本应该有条2200的条带的，，但是几次都没有，不知道是不是模板不够？

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4楼2013-12-17 09:51:43

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xiaopeiliang

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【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-17 13:46:58

引用回帖:

4楼: Originally posted by Tporker at 2013-12-17 09:51:43
请问在进行基因组PCR（5‘AOX/3’AOX）鉴定阳性菌落时候，PCR反应体系设计是否像普通PCR一样模板添加量为整个体系的1/20甚至更少？还是需要多加一点基因组？
体系：
Taq Buffer（含Mg+） 1.5
3AOX ...

做的时候提取点GS115的空白对照基因组做个通用引物PCR看看，每次做之前做好对照，就会排除你的这些问题了，基因组可以电泳看看，不过因为量少而P不到的概率比较小，可能是那个步骤操作没注意吧，实验设计的是没有问题的

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5楼2013-12-17 10:31:21

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