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[交流]
Western Blot技术交流第一期 蛋白样品的获得 已有1人参与
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Western blot实验是目前进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一，其原理是经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。 Western Blot技术根据其的实验操作步骤我们称之为7步法： 第一步：即蛋白样本的获得。 Western Blot实验主要目的是检测蛋白质的表达，所以首先得从实验样本中获取蛋白质，目前使用较多的样本是细胞及哺乳动物组织、其次是细菌及真菌、再后是植物。 细胞及哺乳动物的组织：目前提取与纯化蛋白质最经典的方法是RIPA强、中、弱系列的裂解液及NP-40裂解液、SDS裂解液、哺乳动物蛋白抽提试剂，组织蛋白抽提试剂。这几种裂解液裂解原理相似，但作用效果不同，实验者需要根据自身实验需求来选取合适的裂解方式，例如RIPA（强）裂解液与SDS裂解液是作用效果很强的裂解液，可以使样本充分裂解，获取足够多的蛋白质，使蛋白质充分变性不具有蛋白质活性且较多的基因组等也伴随着提取出来了。RIPA中、弱裂解液及NP-40裂解液、哺乳动物蛋白抽提试剂、组织蛋白抽提试剂则较之温和，其缺点就是样本可能裂解不充分，核、膜蛋白可能提取不完全。具体的选择可以通过下附表进行选择。 细菌样本：细菌蛋白抽提试剂、包涵体蛋白溶解液。 酵母样本：酵母蛋白抽提试剂。 植物样本：植物蛋白抽提试剂。 细胞样本：细胞浆/核/膜蛋白抽提试剂盒。Western Blot实验主要是对蛋白质表达进行相对定量检测，如果有研究者需要对其进行细胞结构中蛋白质组分定位检测就需要用到此方法提取蛋白质，此方法是通过裂解液的裂解强度不同来分别提取同一细胞样本中不同结构的蛋白，这对于研究目的蛋白主要存在细胞于哪个结构中提供必要的技术。 在蛋白的提取过程中，因为实验样本如细胞、组织中本来就存在的各种蛋白酶在裂解过程中被液释放出来降解相应的蛋白质，所以在提取过程中不可避免的要使用到蛋白酶抑制剂，目前蛋白酶抑制剂的种类很多，最常用的是PMSF，最有效的是蛋白酶抑制剂混合物，其包含多种蛋白酶抑制剂，可以有效的防止蛋白在提取过程中蛋白的降解。 |
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2楼2013-12-10 13:53:15
