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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求教，融合蛋白表达条件怎么优化的
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wqertyre

至尊木虫 (职业作家)

[求助] 求教，融合蛋白表达条件怎么优化的 已有1人参与

最近刚刚构建好一段基因，在bl21里面表达，分子量大小估计有70KD，我想优化一下表达条件，包括IPTG的浓度、诱导时间，还有温度，本来想设计正交试验的，可看了几篇中文文献，怎么都没做正交试验呢？是没必要吗？还是太难做了？坐等大神赐教
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善由心生
1楼 2013-12-05 16:52:17
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recca1016

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-12-06 11:37:40
wqertyre: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-12-16 23:21:38
依我的经验，蛋白是否表达，表达量高低几乎都只与蛋白本身有关。温度，iptg，诱导时间点通常只是在已有的基础上提高表达量。
不知道你的蛋白已经表达出来了没，如果表达不出来通常就是要选取表达某一片段进行表达；如果表达出来的话，可以通过降低温度延长时间获得可溶性表达蛋白的量。
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流水不腐，户枢不蠹
2楼2013-12-06 09:28:08
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wqertyre

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
2楼: Originally posted by recca1016 at 2013-12-06 09:28:08
依我的经验，蛋白是否表达，表达量高低几乎都只与蛋白本身有关。温度，iptg，诱导时间点通常只是在已有的基础上提高表达量。
不知道你的蛋白已经表达出来了没，如果表达不出来通常就是要选取表达某一片段进行表达； ...

已经表达出来了，在优化条件
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善由心生
3楼2013-12-09 15:47:05
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夏至1990

金虫 (小有名气)

小小虫
引用回帖:
3楼: Originally posted by wqertyre at 2013-12-09 15:47:05
已经表达出来了，在优化条件...

楼主，你的IPTG诱导浓度是多少啊
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Sodoyouwanttotakealeapoffaith…orbecomeanoldman,filledwithregret…waitingtodiealone?
4楼2014-04-22 15:30:24
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wqertyre

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 夏至1990 at 2014-04-22 15:30:24
楼主，你的IPTG诱导浓度是多少啊...

1mM可以，0.01也可以
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善由心生
5楼2014-04-22 23:39:18
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夏至1990

金虫 (小有名气)

小小虫
★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-04-25 11:12:54
引用回帖:
5楼: Originally posted by wqertyre at 2014-04-22 23:39:18
1mM可以，0.01也可以...

0.01也行啊，我做的事在0.1和0.5.等会结果就出来了。那你是在OD值多少的时候诱导的，我觉得大肠杆菌还是在0.3到0.6之间诱导比较好。试过在1.0和1.1诱导，结果表达量低的啊，心酸啊
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Sodoyouwanttotakealeapoffaith…orbecomeanoldman,filledwithregret…waitingtodiealone?
6楼2014-04-23 15:07:18
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?雱�

新虫 (初入文坛)
不知道，也正在发愁呢
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7楼2014-04-23 15:42:59
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wqertyre

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 夏至1990 at 2014-04-23 15:07:18
0.01也行啊，我做的事在0.1和0.5.等会结果就出来了。那你是在OD值多少的时候诱导的，我觉得大肠杆菌还是在0.3到0.6之间诱导比较好。试过在1.0和1.1诱导，结果表达量低的啊，心酸啊...

很多虫子都说是在0.6-0.8之间的时候加诱导剂，你可以从基因方面找点突破口
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善由心生
8楼2014-04-24 20:29:22
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wqertyre

至尊木虫 (职业作家)
???????:
7?: Originally posted by ??? at 2014-04-23 15:42:59
?????????????????

???????????????????
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善由心生
9楼2014-04-24 20:30:27
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夏至1990

金虫 (小有名气)

小小虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
wqertyre: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-05-03 10:50:18
现在做的比较好了。诱导浓度0.1和0.5mM都没有太大区别。我做个8个对照。诱导浓度做过1.左右的，觉得还是0.3到哦，6比较好。不过最重要的还是你的菌，你的转化，建议每次做的时候，菌株都要重新转化，因为我的重组菌株保菌后，蛋白表达量下降很多。保菌甘油浓度控制第一点。温度是37摄氏度，这个师兄之前做过20.25.30都做过。希望给你帮助，少走弯路，加油
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Sodoyouwanttotakealeapoffaith…orbecomeanoldman,filledwithregret…waitingtodiealone?
10楼2014-04-29 11:30:39
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