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请教140KD蛋白的转膜条件
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| 请教各位前辈，最近在做 TLR7140kd的蛋白，试过的转膜条件有恒压100v（电流在236ma左右）,转2小时；横流300ma(电压在135v左右)2小时，转完膜后用丽春红染膜，可以看到170kd的蛋白条带，用的是（10-170kd）的Marker，但显影的时候我的目的条带没有出现，用的一抗是CST的推荐浓度1：1000,1:800，均试过，二抗1:5000，1:8000，1:9000,1：10000，140kd的条带始终没有出现，170kd的条带却压出来了，虽然条带很细，而且背景也很深请问各位前辈我的转膜条件有问题吗？还是需要提高一抗浓度？应该如何改进，请各位前辈不吝赐教，谢谢，急急急！ |
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2楼2013-10-06 00:24:31
ljsh
铁杆木虫 (著名写手)
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gyesang: 金币+2, 鼓励应助！ 2013-10-07 01:30:50
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你那170大小的也有可能就是你的目的条带。不知道你用的是什么蛋白MARKER，你可以确定你显出来的条带是170kDa吗？ 如果想增强信号的话。不知道你用的是什么细胞裂解缓冲液，比如说你可以直接用LOADING BUFFER去裂解细胞，这样裂解比较充分。还有THERMO（以前的PIERCE）出一种super ECL的底物，可以增强信号。 不过还是建议你最好能拿到个质粒，这样可以确定那170的是否是你的目的条带。你可以考虑去找已经发表过文章的作者要，一般都会给，或者你去ADDGENE看看。买一个质粒也不贵 祝好运 |
8楼2013-10-06 23:27:13
9楼2013-10-06 23:36:02
10楼2013-10-07 03:10:03