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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 请教140KD蛋白的转膜条件
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Silenceli

铁虫 (小有名气)

[求助] 请教140KD蛋白的转膜条件

请教各位前辈，最近在做  TLR7140kd的蛋白，试过的转膜条件有恒压100v（电流在236ma左右）,转2小时；横流300ma(电压在135v左右)2小时，转完膜后用丽春红染膜，可以看到170kd的蛋白条带，用的是（10-170kd）的Marker，但显影的时候我的目的条带没有出现，用的一抗是CST的推荐浓度1：1000,1:800，均试过，二抗1:5000，1:8000，1:9000,1：10000，140kd的条带始终没有出现，170kd的条带却压出来了，虽然条带很细，而且背景也很深请问各位前辈我的转膜条件有问题吗？还是需要提高一抗浓度？应该如何改进，请各位前辈不吝赐教，谢谢，急急急！
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1楼 2013-10-05 21:11:31
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DAX1

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-06 02:02:23
Silenceli: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-10-06 22:52:08
Cst的抗体一般没问题，不过还是建议楼主可以过表达下蛋白，检测下抗体特异性以及到底多大。还有内源蛋白最好转膜过夜，10%胶可以恒流50毫安。然后一抗过夜。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2013-10-06 00:24:31
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ljsh

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我们转膜条件：150mA 120min
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3楼2013-10-06 08:28:25
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Silenceli

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by DAX1 at 2013-10-06 00:24:31
Cst的抗体一般没问题，不过还是建议楼主可以过表达下蛋白，检测下抗体特异性以及到底多大。还有内源蛋白最好转膜过夜，10%胶可以恒流50毫安。然后一抗过夜。
...

恩好的，请问过表达是不是将一抗的浓度提高到最大如1:100,是这样吗？推荐浓度是1:1000，
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4楼2013-10-06 22:51:56
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Silenceli

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ljsh at 2013-10-06 08:28:25
我们转膜条件：150mA 120min

请问您做的是分子量是140的蛋白？还是TLR7？
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5楼2013-10-06 22:54:56
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DAX1

新虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-07 01:30:42
引用回帖:
4楼: Originally posted by Silenceli at 2013-10-06 22:51:56
恩好的，请问过表达是不是将一抗的浓度提高到最大如1:100,是这样吗？推荐浓度是1:1000，...

不是的，我的意思是你有没有TLR7的质粒，你在293T细胞中转染这个质粒，然后去抗体去抗。检测下抗体的效果。
一般很少用1：100的，1：1000没效果的话改变浓度也够呛
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6楼2013-10-06 22:57:42
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Silenceli

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by DAX1 at 2013-10-06 22:57:42
不是的，我的意思是你有没有TLR7的质粒，你在293T细胞中转染这个质粒，然后去抗体去抗。检测下抗体的效果。
一般很少用1：100的，1：1000没效果的话改变浓度也够呛...

我们没有TLR7的质粒，买的是CST的抗体初学有好多不懂的地方请多多包涵，若不改变一抗浓度如何才能让140的条带才能压出来，能压出一条很细的170的条带，请您指教，谢谢
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7楼2013-10-06 23:01:44
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DAX1

新虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励应助！ 2013-10-07 01:30:50
引用回帖:
7楼: Originally posted by Silenceli at 2013-10-06 23:01:44
我们没有TLR7的质粒，买的是CST的抗体初学有好多不懂的地方请多多包涵，若不改变一抗浓度如何才能让140的条带才能压出来，能压出一条很细的170的条带，请您指教，谢谢...

你那170大小的也有可能就是你的目的条带。不知道你用的是什么蛋白MARKER，你可以确定你显出来的条带是170kDa吗？
如果想增强信号的话。不知道你用的是什么细胞裂解缓冲液，比如说你可以直接用LOADING BUFFER去裂解细胞，这样裂解比较充分。还有THERMO（以前的PIERCE）出一种super ECL的底物，可以增强信号。
不过还是建议你最好能拿到个质粒，这样可以确定那170的是否是你的目的条带。你可以考虑去找已经发表过文章的作者要，一般都会给，或者你去ADDGENE看看。买一个质粒也不贵
祝好运
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8楼2013-10-06 23:27:13
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Silenceli

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by DAX1 at 2013-10-06 23:27:13
你那170大小的也有可能就是你的目的条带。不知道你用的是什么蛋白MARKER，你可以确定你显出来的条带是170kDa吗？
如果想增强信号的话。不知道你用的是什么细胞裂解缓冲液，比如说你可以直接用LOADING BUFFER去裂解 ...

我用的是thermo的10-170的marker，根据我裁剪的膜的大小与压出来的片子比对，那个条带是在170的位置，用的碧云天的裂解液（增强型），我做的是肺组织，用的发光液是millipore的
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9楼2013-10-06 23:36:02
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DAX1

新虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-29 09:51:45
引用回帖:
9楼: Originally posted by Silenceli at 2013-10-06 23:36:02
我用的是thermo的10-170的marker，根据我裁剪的膜的大小与压出来的片子比对，那个条带是在170的位置，用的碧云天的裂解液（增强型），我做的是肺组织，用的发光液是millipore的...

你用的是10%的还是8%的胶？marker分的开吗？
我看了下cst的database，他们那除了140的还有其他的带，你的能看到吗？还有他们可以在hela细胞中检测到140的带。这个细胞你们实验室应该有吧。下次跑电泳时带上hela的细胞裂解液作对照。还抗不出来就得考虑抗体问题了（不过话说回来，用过很多cst得抗体基本上没出现过问题）。
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10楼2013-10-07 03:10:03
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