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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 请教140KD蛋白的转膜条件
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Silenceli

铁虫 (小有名气)

[求助] 请教140KD蛋白的转膜条件

请教各位前辈，最近在做  TLR7140kd的蛋白，试过的转膜条件有恒压100v（电流在236ma左右）,转2小时；横流300ma(电压在135v左右)2小时，转完膜后用丽春红染膜，可以看到170kd的蛋白条带，用的是（10-170kd）的Marker，但显影的时候我的目的条带没有出现，用的一抗是CST的推荐浓度1：1000,1:800，均试过，二抗1:5000，1:8000，1:9000,1：10000，140kd的条带始终没有出现，170kd的条带却压出来了，虽然条带很细，而且背景也很深请问各位前辈我的转膜条件有问题吗？还是需要提高一抗浓度？应该如何改进，请各位前辈不吝赐教，谢谢，急急急！
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1楼 2013-10-05 21:11:31
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Silenceli

铁虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by DAX1 at 2013-10-06 00:24:31
Cst的抗体一般没问题，不过还是建议楼主可以过表达下蛋白，检测下抗体特异性以及到底多大。还有内源蛋白最好转膜过夜，10%胶可以恒流50毫安。然后一抗过夜。
...

恩好的，请问过表达是不是将一抗的浓度提高到最大如1:100,是这样吗？推荐浓度是1:1000，
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4楼2013-10-06 22:51:56
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Silenceli

铁虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by ljsh at 2013-10-06 08:28:25
我们转膜条件：150mA 120min

请问您做的是分子量是140的蛋白？还是TLR7？
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5楼2013-10-06 22:54:56
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Silenceli

铁虫 (小有名气)
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6楼: Originally posted by DAX1 at 2013-10-06 22:57:42
不是的，我的意思是你有没有TLR7的质粒，你在293T细胞中转染这个质粒，然后去抗体去抗。检测下抗体的效果。
一般很少用1：100的，1：1000没效果的话改变浓度也够呛...

我们没有TLR7的质粒，买的是CST的抗体初学有好多不懂的地方请多多包涵，若不改变一抗浓度如何才能让140的条带才能压出来，能压出一条很细的170的条带，请您指教，谢谢
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7楼2013-10-06 23:01:44
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Silenceli

铁虫 (小有名气)
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8楼: Originally posted by DAX1 at 2013-10-06 23:27:13
你那170大小的也有可能就是你的目的条带。不知道你用的是什么蛋白MARKER，你可以确定你显出来的条带是170kDa吗？
如果想增强信号的话。不知道你用的是什么细胞裂解缓冲液，比如说你可以直接用LOADING BUFFER去裂解 ...

我用的是thermo的10-170的marker，根据我裁剪的膜的大小与压出来的片子比对，那个条带是在170的位置，用的碧云天的裂解液（增强型），我做的是肺组织，用的发光液是millipore的
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9楼2013-10-06 23:36:02
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Silenceli

铁虫 (小有名气)
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11楼: Originally posted by feilinshiji at 2013-10-07 12:14:01
TLR的表达一直是个难点，楼主厉害

麻烦请教一下TLR7（分子量140）的表达很低吗请问您做过相关研究？请指教~上样量40微克，一抗试了推荐浓度1:1000，1:800,1:600都没有在分子量140的位置压出条带，但在170的位置能压出很细的条带，若是170的位置能压出条带是不是说明我的转膜没有问题，但不知为什么140的位置压不出条带很是费解，请您多多指教~
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feilinshiji
12楼2013-10-07 13:49:19
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Silenceli

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by DAX1 at 2013-10-07 03:10:03
你用的是10%的还是8%的胶？marker分的开吗？
我看了下cst的database，他们那除了140的还有其他的带，你的能看到吗？还有他们可以在hela细胞中检测到140的带。这个细胞你们实验室应该有吧。下次跑电泳时带上hela的 ...

用的是10%的分离胶，marker能跑到开marker的条带很清楚，我剪膜的时候剪的是分子量100-170的位置其他分子量的没有剪也就没有孵育一抗，但在170的位置能压出很细的条带来，不知是什么原因，TLR7是多抗的原因吗？170的位置能压出条带是不是说明我的转膜没有问题？不好意思我们实验室没有做细胞这一块所以也没法做，我的另一个抗体NFKBP65也是CST的那个就摸出条件来了，TLR7会是表达低吗？我应该如何继续往下做，马上就要毕业了很是着急，感谢您的指导~
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13楼2013-10-07 13:56:47
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Silenceli

铁虫 (小有名气)
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14楼: Originally posted by DAX1 at 2013-10-07 15:32:08
如果你担心转膜不完全的话，你可以将转膜后的胶用考马斯染色看看。我做过200多的蛋白，恒流50毫安转膜过夜，抗内源没问题。
说实话，你现在这个没有对照，虽然有170的条带，但完全不知道是什么，一般情况下cst的抗 ...

我用考马斯蓝染胶，在最上面好像有条带，但那个位置肯定不是140的位置，我的转膜条件是100V2小时10分钟，查文献上他们用的抗体是Abcam和santa cruz的分子量是121kd,有点不明白就是不同厂家的抗体分子量还不一样吗？分子量不都是固定的吗？恩好的我再查查文献看看~现在面临毕业找工作，看其他实验室的同学都做完了在准备各种考试，自己还在这做着就有些着急了，而且这个实验每次做出的重现性也不好，现在竞争那么厉害机会是给有准备的人而我没好好准备怎么能找到一个好工作呢？所以就有点着急了呵呵见笑了
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15楼2013-10-07 17:06:54
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Silenceli

铁虫 (小有名气)
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10楼: Originally posted by DAX1 at 2013-10-07 03:10:03
你用的是10%的还是8%的胶？marker分的开吗？
我看了下cst的database，他们那除了140的还有其他的带，你的能看到吗？还有他们可以在hela细胞中检测到140的带。这个细胞你们实验室应该有吧。下次跑电泳时带上hela的 ...

您好，我用的是10%的胶，marker能分的开，这段时间有做了一次，除了140的位置的条带，在100,50左右能出来条带，但140的位置的条带就是没有，我把图发上去请您指教，谢谢
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18楼2013-10-29 08:59:48
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Silenceli

铁虫 (小有名气)
这是这次刚做出来的结果~
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