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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 请教140KD蛋白的转膜条件
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Silenceli

铁虫 (小有名气)

[求助] 请教140KD蛋白的转膜条件

请教各位前辈，最近在做  TLR7140kd的蛋白，试过的转膜条件有恒压100v（电流在236ma左右）,转2小时；横流300ma(电压在135v左右)2小时，转完膜后用丽春红染膜，可以看到170kd的蛋白条带，用的是（10-170kd）的Marker，但显影的时候我的目的条带没有出现，用的一抗是CST的推荐浓度1：1000,1:800，均试过，二抗1:5000，1:8000，1:9000,1：10000，140kd的条带始终没有出现，170kd的条带却压出来了，虽然条带很细，而且背景也很深请问各位前辈我的转膜条件有问题吗？还是需要提高一抗浓度？应该如何改进，请各位前辈不吝赐教，谢谢，急急急！
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1楼 2013-10-05 21:11:31
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Silenceli

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by DAX1 at 2013-10-07 15:32:08
如果你担心转膜不完全的话，你可以将转膜后的胶用考马斯染色看看。我做过200多的蛋白，恒流50毫安转膜过夜，抗内源没问题。
说实话，你现在这个没有对照，虽然有170的条带，但完全不知道是什么，一般情况下cst的抗 ...

我用考马斯蓝染胶，在最上面好像有条带，但那个位置肯定不是140的位置，我的转膜条件是100V2小时10分钟，查文献上他们用的抗体是Abcam和santa cruz的分子量是121kd,有点不明白就是不同厂家的抗体分子量还不一样吗？分子量不都是固定的吗？恩好的我再查查文献看看~现在面临毕业找工作，看其他实验室的同学都做完了在准备各种考试，自己还在这做着就有些着急了，而且这个实验每次做出的重现性也不好，现在竞争那么厉害机会是给有准备的人而我没好好准备怎么能找到一个好工作呢？所以就有点着急了呵呵见笑了
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15楼2013-10-07 17:06:54
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DAX1

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-06 02:02:23
Silenceli: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-10-06 22:52:08
Cst的抗体一般没问题，不过还是建议楼主可以过表达下蛋白，检测下抗体特异性以及到底多大。还有内源蛋白最好转膜过夜，10%胶可以恒流50毫安。然后一抗过夜。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2013-10-06 00:24:31
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ljsh

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我们转膜条件：150mA 120min
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3楼2013-10-06 08:28:25
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Silenceli

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by DAX1 at 2013-10-06 00:24:31
Cst的抗体一般没问题，不过还是建议楼主可以过表达下蛋白，检测下抗体特异性以及到底多大。还有内源蛋白最好转膜过夜，10%胶可以恒流50毫安。然后一抗过夜。
...

恩好的，请问过表达是不是将一抗的浓度提高到最大如1:100,是这样吗？推荐浓度是1:1000，
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4楼2013-10-06 22:51:56
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