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请教140KD蛋白的转膜条件
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| 请教各位前辈，最近在做 TLR7140kd的蛋白，试过的转膜条件有恒压100v（电流在236ma左右）,转2小时；横流300ma(电压在135v左右)2小时，转完膜后用丽春红染膜，可以看到170kd的蛋白条带，用的是（10-170kd）的Marker，但显影的时候我的目的条带没有出现，用的一抗是CST的推荐浓度1：1000,1:800，均试过，二抗1:5000，1:8000，1:9000,1：10000，140kd的条带始终没有出现，170kd的条带却压出来了，虽然条带很细，而且背景也很深请问各位前辈我的转膜条件有问题吗？还是需要提高一抗浓度？应该如何改进，请各位前辈不吝赐教，谢谢，急急急！ |
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2楼2013-10-06 00:24:31
6楼2013-10-06 22:57:42
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gyesang: 金币+2, 鼓励应助！ 2013-10-07 01:30:50
gyesang: 金币+2, 鼓励应助！ 2013-10-07 01:30:50
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你那170大小的也有可能就是你的目的条带。不知道你用的是什么蛋白MARKER，你可以确定你显出来的条带是170kDa吗？ 如果想增强信号的话。不知道你用的是什么细胞裂解缓冲液，比如说你可以直接用LOADING BUFFER去裂解细胞，这样裂解比较充分。还有THERMO（以前的PIERCE）出一种super ECL的底物，可以增强信号。 不过还是建议你最好能拿到个质粒，这样可以确定那170的是否是你的目的条带。你可以考虑去找已经发表过文章的作者要，一般都会给，或者你去ADDGENE看看。买一个质粒也不贵 祝好运 |
8楼2013-10-06 23:27:13
10楼2013-10-07 03:10:03
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-29 09:52:12
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-29 09:52:12
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如果你担心转膜不完全的话，你可以将转膜后的胶用考马斯染色看看。我做过200多的蛋白，恒流50毫安转膜过夜，抗内源没问题。 说实话，你现在这个没有对照，虽然有170的条带，但完全不知道是什么，一般情况下cst的抗体是值得信任的。不过你这个差异30个kda的确有点大，虽然在不同组织中蛋白的大小可能会有所差异。这个与是否多抗或者单抗应该没有多大的关系。不知道你有没有看过别人文献报道在你们所用组织中的tlr7大小。还有如果你裂解液还多的话，可以考虑一抗整张膜，看看下面的条带是否还在。 至于hela的细胞裂解液，你们附近的实验室都没有做细胞实验的吗？或者找碧云天这样的公司应该有卖裂解液的吧？ 至于tlr7的表达情况，你可以去biogps这个网站看看，可以参考下他们的数据。 至于毕业，希望你能耐心点，延期一点时间到也没什么，如果能发出篇文章，对你以后申请位置的会有很大的帮助。我硕士的时候就延期半年了，最后发了个5左右的文章。虽然当时有很多的不甘，但现在回想起来还是值得的。 |
14楼2013-10-07 15:32:08
16楼2013-10-07 17:15:13
21楼2013-10-29 20:10:59