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Silenceli

铁虫 (小有名气)

[求助] 请教140KD蛋白的转膜条件

请教各位前辈,最近在做  TLR7140kd的蛋白,试过的转膜条件有恒压100v(电流在236ma左右),转2小时;横流300ma(电压在135v左右)2小时,转完膜后用丽春红染膜,可以看到170kd的蛋白条带,用的是(10-170kd)的Marker,但显影的时候我的目的条带没有出现,用的一抗是CST的推荐浓度1:1000,1:800,均试过,二抗1:5000,1:8000,1:9000,1:10000,140kd的条带始终没有出现,170kd的条带却压出来了,虽然条带很细,而且背景也很深请问各位前辈我的转膜条件有问题吗?还是需要提高一抗浓度?应该如何改进,请各位前辈不吝赐教,谢谢,急急急!
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Silenceli

铁虫 (小有名气)

这是这次刚做出来的结果~

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  • 附件 1 : 合并m.Tif
  • 2013-10-29 09:01:53, 3 M
  • 附件 2 : TLR7.jpg
  • 2013-10-29 09:02:10, 19.44 K
  • 附件 3 : 合并marker.jpg
  • 2013-10-29 09:02:20, 76.58 K
19楼2013-10-29 09:02:58
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查看全部 21 个回答

DAX1

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-10-06 02:02:23
Silenceli: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-10-06 22:52:08
Cst的抗体一般没问题,不过还是建议楼主可以过表达下蛋白,检测下抗体特异性以及到底多大。还有内源蛋白最好转膜过夜,10%胶可以恒流50毫安。然后一抗过夜。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
2楼2013-10-06 00:24:31
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ljsh

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我们转膜条件:150mA 120min
3楼2013-10-06 08:28:25
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Silenceli

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by DAX1 at 2013-10-06 00:24:31
Cst的抗体一般没问题,不过还是建议楼主可以过表达下蛋白,检测下抗体特异性以及到底多大。还有内源蛋白最好转膜过夜,10%胶可以恒流50毫安。然后一抗过夜。
...

恩好的,请问过表达是不是将一抗的浓度提高到最大如1:100,是这样吗?推荐浓度是1:1000,
4楼2013-10-06 22:51:56
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