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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 请教140KD蛋白的转膜条件
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Silenceli

铁虫 (小有名气)

[求助] 请教140KD蛋白的转膜条件

请教各位前辈，最近在做  TLR7140kd的蛋白，试过的转膜条件有恒压100v（电流在236ma左右）,转2小时；横流300ma(电压在135v左右)2小时，转完膜后用丽春红染膜，可以看到170kd的蛋白条带，用的是（10-170kd）的Marker，但显影的时候我的目的条带没有出现，用的一抗是CST的推荐浓度1：1000,1:800，均试过，二抗1:5000，1:8000，1:9000,1：10000，140kd的条带始终没有出现，170kd的条带却压出来了，虽然条带很细，而且背景也很深请问各位前辈我的转膜条件有问题吗？还是需要提高一抗浓度？应该如何改进，请各位前辈不吝赐教，谢谢，急急急！
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1楼 2013-10-05 21:11:31
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Silenceli

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by DAX1 at 2013-10-07 03:10:03
你用的是10%的还是8%的胶？marker分的开吗？
我看了下cst的database，他们那除了140的还有其他的带，你的能看到吗？还有他们可以在hela细胞中检测到140的带。这个细胞你们实验室应该有吧。下次跑电泳时带上hela的 ...

用的是10%的分离胶，marker能跑到开marker的条带很清楚，我剪膜的时候剪的是分子量100-170的位置其他分子量的没有剪也就没有孵育一抗，但在170的位置能压出很细的条带来，不知是什么原因，TLR7是多抗的原因吗？170的位置能压出条带是不是说明我的转膜没有问题？不好意思我们实验室没有做细胞这一块所以也没法做，我的另一个抗体NFKBP65也是CST的那个就摸出条件来了，TLR7会是表达低吗？我应该如何继续往下做，马上就要毕业了很是着急，感谢您的指导~
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13楼2013-10-07 13:56:47
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DAX1

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-06 02:02:23
Silenceli: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-10-06 22:52:08
Cst的抗体一般没问题，不过还是建议楼主可以过表达下蛋白，检测下抗体特异性以及到底多大。还有内源蛋白最好转膜过夜，10%胶可以恒流50毫安。然后一抗过夜。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2013-10-06 00:24:31
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ljsh

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我们转膜条件：150mA 120min
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3楼2013-10-06 08:28:25
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Silenceli

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by DAX1 at 2013-10-06 00:24:31
Cst的抗体一般没问题，不过还是建议楼主可以过表达下蛋白，检测下抗体特异性以及到底多大。还有内源蛋白最好转膜过夜，10%胶可以恒流50毫安。然后一抗过夜。
...

恩好的，请问过表达是不是将一抗的浓度提高到最大如1:100,是这样吗？推荐浓度是1:1000，
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4楼2013-10-06 22:51:56
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