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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 请教140KD蛋白的转膜条件
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feilinshiji

银虫 (小有名气)
TLR的表达一直是个难点，楼主厉害
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11楼2013-10-07 12:14:01
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Silenceli

铁虫 (小有名气)
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11楼: Originally posted by feilinshiji at 2013-10-07 12:14:01
TLR的表达一直是个难点，楼主厉害

麻烦请教一下TLR7（分子量140）的表达很低吗请问您做过相关研究？请指教~上样量40微克，一抗试了推荐浓度1:1000，1:800,1:600都没有在分子量140的位置压出条带，但在170的位置能压出很细的条带，若是170的位置能压出条带是不是说明我的转膜没有问题，但不知为什么140的位置压不出条带很是费解，请您多多指教~
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feilinshiji
12楼2013-10-07 13:49:19
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Silenceli

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by DAX1 at 2013-10-07 03:10:03
你用的是10%的还是8%的胶？marker分的开吗？
我看了下cst的database，他们那除了140的还有其他的带，你的能看到吗？还有他们可以在hela细胞中检测到140的带。这个细胞你们实验室应该有吧。下次跑电泳时带上hela的 ...

用的是10%的分离胶，marker能跑到开marker的条带很清楚，我剪膜的时候剪的是分子量100-170的位置其他分子量的没有剪也就没有孵育一抗，但在170的位置能压出很细的条带来，不知是什么原因，TLR7是多抗的原因吗？170的位置能压出条带是不是说明我的转膜没有问题？不好意思我们实验室没有做细胞这一块所以也没法做，我的另一个抗体NFKBP65也是CST的那个就摸出条件来了，TLR7会是表达低吗？我应该如何继续往下做，马上就要毕业了很是着急，感谢您的指导~
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13楼2013-10-07 13:56:47
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DAX1

新虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-29 09:52:12
引用回帖:
13楼: Originally posted by Silenceli at 2013-10-07 13:56:47
用的是10%的分离胶，marker能跑到开marker的条带很清楚，我剪膜的时候剪的是分子量100-170的位置其他分子量的没有剪也就没有孵育一抗，但在170的位置能压出很细的条带来，不知是什么原因，TLR7是多抗的原因吗？170 ...

如果你担心转膜不完全的话，你可以将转膜后的胶用考马斯染色看看。我做过200多的蛋白，恒流50毫安转膜过夜，抗内源没问题。
说实话，你现在这个没有对照，虽然有170的条带，但完全不知道是什么，一般情况下cst的抗体是值得信任的。不过你这个差异30个kda的确有点大，虽然在不同组织中蛋白的大小可能会有所差异。这个与是否多抗或者单抗应该没有多大的关系。不知道你有没有看过别人文献报道在你们所用组织中的tlr7大小。还有如果你裂解液还多的话，可以考虑一抗整张膜，看看下面的条带是否还在。
至于hela的细胞裂解液，你们附近的实验室都没有做细胞实验的吗？或者找碧云天这样的公司应该有卖裂解液的吧？
至于tlr7的表达情况，你可以去biogps这个网站看看，可以参考下他们的数据。
至于毕业，希望你能耐心点，延期一点时间到也没什么，如果能发出篇文章，对你以后申请位置的会有很大的帮助。我硕士的时候就延期半年了，最后发了个5左右的文章。虽然当时有很多的不甘，但现在回想起来还是值得的。
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14楼2013-10-07 15:32:08
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Silenceli

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by DAX1 at 2013-10-07 15:32:08
如果你担心转膜不完全的话，你可以将转膜后的胶用考马斯染色看看。我做过200多的蛋白，恒流50毫安转膜过夜，抗内源没问题。
说实话，你现在这个没有对照，虽然有170的条带，但完全不知道是什么，一般情况下cst的抗 ...

我用考马斯蓝染胶，在最上面好像有条带，但那个位置肯定不是140的位置，我的转膜条件是100V2小时10分钟，查文献上他们用的抗体是Abcam和santa cruz的分子量是121kd,有点不明白就是不同厂家的抗体分子量还不一样吗？分子量不都是固定的吗？恩好的我再查查文献看看~现在面临毕业找工作，看其他实验室的同学都做完了在准备各种考试，自己还在这做着就有些着急了，而且这个实验每次做出的重现性也不好，现在竞争那么厉害机会是给有准备的人而我没好好准备怎么能找到一个好工作呢？所以就有点着急了呵呵见笑了
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15楼2013-10-07 17:06:54
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DAX1

新虫 (小有名气)
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16楼2013-10-07 17:15:13
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feilinshiji

银虫 (小有名气)
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12楼: Originally posted by Silenceli at 2013-10-07 13:49:19
麻烦请教一下TLR7（分子量140）的表达很低吗请问您做过相关研究？请指教~上样量40微克，一抗试了推荐浓度1:1000，1:800,1:600都没有在分子量140的位置压出条带，但在170的位置能压出很细的条带，若是170的位置能压 ...

我没做过TLR的表达，但是我们实验室有人做过TLR相关的课题，中途需要TLR的抗体，结果死活表达不出来，最后找公司做，公司说TLR表达属于一个难点问题，不保证能表达出来。主要是TLR属于多次跨膜蛋白，结果非常复杂
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17楼2013-10-08 08:34:47
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Silenceli

铁虫 (小有名气)
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10楼: Originally posted by DAX1 at 2013-10-07 03:10:03
你用的是10%的还是8%的胶？marker分的开吗？
我看了下cst的database，他们那除了140的还有其他的带，你的能看到吗？还有他们可以在hela细胞中检测到140的带。这个细胞你们实验室应该有吧。下次跑电泳时带上hela的 ...

您好，我用的是10%的胶，marker能分的开，这段时间有做了一次，除了140的位置的条带，在100,50左右能出来条带，但140的位置的条带就是没有，我把图发上去请您指教，谢谢
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18楼2013-10-29 08:59:48
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Silenceli

铁虫 (小有名气)
这是这次刚做出来的结果~
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19楼2013-10-29 09:02:58
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Silenceli

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
19楼: Originally posted by Silenceli at 2013-10-29 09:02:58
这是这次刚做出来的结果~

请大家帮忙指教一下，谢谢
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20楼2013-10-29 09:03:29
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