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猪猪侠波

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[求助] 简并引物测序

求教谁遇到过这样的情况，你们是什么解决的，我送菌液测序，上游引物是简并引物，下游正常测出结果，简并引物出现测序结果无信号的问题，说可能原因是样品结合位点不存在或者破坏，建议方案是换引物或者重新提供样品，请问这个会是简并引物的问题吗？怎么解决，本人新手

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1楼 2013-12-02 13:36:19

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-02 16:12:08
猪猪侠波: 金币+15, ★★★很有帮助, 有帮助 2013-12-05 08:32:19

你送的是菌液说明你已经将产物片段连接到了载体上，送出测序前应该做下PCR检测以及酶切检测，确定你的片段在质粒上。如果一条引物测不出来可以选用质粒上自带的序列作为测序引物试一下，先不用怀疑自己的引物问题。其实很多情况下测序公司也是稀里糊涂的。

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2楼2013-12-02 16:07:17

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2楼: Originally posted by wjswj at 2013-12-02 16:07:17
你送的是菌液说明你已经将产物片段连接到了载体上，送出测序前应该做下PCR检测以及酶切检测，确定你的片段在质粒上。如果一条引物测不出来可以选用质粒上自带的序列作为测序引物试一下，先不用怀疑自己的引物问题。 ...

我用的是T载，pmd19,不知道怎么搞啊，新手，能具体点吗？

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3楼2013-12-02 16:47:45

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3楼: Originally posted by 猪猪侠波 at 2013-12-02 16:47:45
我用的是T载，pmd19,不知道怎么搞啊，新手，能具体点吗？...

看看T载体说明书，上面会有相关的质粒图，通常会有T7啊M13啊之类的序列，通用测序引物就是在这几个位点设计的。只需告诉测序公司用相应的引物测序即可。

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4楼2013-12-04 13:07:38

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4楼: Originally posted by wjswj at 2013-12-04 13:07:38
看看T载体说明书，上面会有相关的质粒图，通常会有T7啊M13啊之类的序列，通用测序引物就是在这几个位点设计的。只需告诉测序公司用相应的引物测序即可。...

谢谢指点！我只说了用T19通用引物，双向测，然后还是出了问题，有一半只测出来四百多的bp,说是GC含量太高。另外一段七百多，我要测的序列是八百多，这结果能用吗？

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5楼2013-12-05 08:31:08

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5楼: Originally posted by 猪猪侠波 at 2013-12-05 08:31:08
谢谢指点！我只说了用T19通用引物，双向测，然后还是出了问题，有一半只测出来四百多的bp,说是GC含量太高。另外一段七百多，我要测的序列是八百多，这结果能用吗？...

双向加起来有1.1K了，应该可以拼接成一个完整序列了。

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6楼2013-12-05 09:37:20

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