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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 简并引物的简并度多少正常
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hraikeyan

金虫 (小有名气)

[求助] 简并引物的简并度多少正常

一般简并引物的简并度大概多少正常?
简并引物PCR的退火温度能超过60度吗？（我做的梯度PCR，在58——63度都有条带）
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nothing isimpossible
1楼2012-05-28 22:38:38
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wanghd2826

铁虫 (小有名气)
★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-29 13:52:13
1、一般来说，简并度在1024之内正常，但是超过1024是很常见的事。自己做过几对简并引物都大于1024，但是后来扩增都没问题。简并度高是因为简并引物中的N，如果有钱，可以用i（次黄嘌呤）代替N，这样简并度就会减少很多，一般都能达到要求。
2、简并引物的退火温度一般都不高，这样有利于引物本身更好的与模板相结合。简并度稍高的简并引物退火温度尽量不要超过60°，50°左右最好。
希望对lz有所帮助。
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2楼2012-05-29 09:10:37
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wanghd2826 at 2012-05-29 09:10:37
1、一般来说，简并度在1024之内正常，但是超过1024是很常见的事。自己做过几对简并引物都大于1024，但是后来扩增都没问题。简并度高是因为简并引物中的N，如果有钱，可以用i（次黄嘌呤）代替N，这样简并度就会减少很 ...

请问简并引物设计时是以氨基酸序列做参考还是碱基序列作参考。
之前将几种氨基酸序列做比对，找到保守序列在将其中一条序列输入primer5里面，设计的兼并引物的简并度很高。
但是如果将对应的碱基序列作对比，在相同的保守区，人工设计简并引物，简并度很低，一般都不超过100，请问我该怎么设计？以哪个作参考？
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nothing isimpossible
3楼2012-05-30 09:11:07
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wanghd2826

铁虫 (小有名气)
★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-30 13:42:52
引用回帖:
3楼: Originally posted by hraikeyan at 2012-05-30 09:11:07
请问简并引物设计时是以氨基酸序列做参考还是碱基序列作参考。
之前将几种氨基酸序列做比对，找到保守序列在将其中一条序列输入primer5里面，设计的兼并引物的简并度很高。
但是如果将对应的碱基序列作对比，在相 ...

简并引物一般是要以氨基酸保守序列来参考的，因为密码子的简并性缘故，只有氨基酸的序列才是相对保守的。个人感觉用软件设计的简并引物并不可靠，不如自己设计。找到保守的氨基酸序列后，一般上下游各找到7-9个连续的相对保守的氨基酸区域，之后根据简并密码子表就可以轻松翻译出来。尽量不要以碱基作为参考，并不是很准确。
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4楼2012-05-30 11:04:17
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孟孟525

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
无需奖励，只是觉得退火温度低于72摄氏度应该都可以
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5楼2012-05-31 16:04:19
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