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兼并引物的一些问题
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| 我设计了一对兼并引物，扩增出来和理论值长度相似的片段。但测序结果显示并不是我想要的酶的基因片段，并且通过基因比对和自己当初设计兼并引物时参考的菌的该酶的基因相似度就30%。请问还有需要做RACE,酶切，连接，转化，表达·····的必要吗？是否在此就该放弃，另找出路？ |
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2楼2012-07-12 18:22:16
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因为密码子有简并性，所以通常同一个基因的氨基酸序列相似性应该会高于核酸序列吧。基因克隆我没做过，我也不知道30％的氨基酸序列相似度是什么标准，如果比通常的基因克隆标准低的话，那lz你还是放弃然后重新P吧。 嗯，如果你有余力的话，可以试试把这段序列翻译成核酸序列再去比对，说不定会有新发现 建议你找简并性低的氨基酸序列设计简并引物，以尽量减少引物的数量，甚至可以将一对简并引物分成N对不同组成的引物（比如本来上游有4个简并引物，下游有5个简并引物，你可以分成4组，其中每组各有1个上游引物，下游依然是原来的5个），由于有效引物浓度太低或是形成引物二聚体等原因而导致简并PCR失败其实很正常，lz再多多尝试吧。 |
4楼2012-07-15 12:08:19