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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求教，荧光定量PCR标曲问题
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)

[求助] 求教，荧光定量PCR标曲问题

本人做标曲做了5个点，但是总是有一个点没做好，剔除那个点后，线性还算好，扩增效率90%~110%之间，引物特异性是考察过的，有稍微的引物峰，但未超过阈值，因为做过几次了，还是这样，且做实验试剂耗材已用完，仪器使用需收费，想了解下，4个点虽然不严谨，但可否接受呢？在此附上图片，请大侠分析，谢谢啦！
求教，荧光定量PCR标曲问题
1.jpg


求教，荧光定量PCR标曲问题-1
2.jpg
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思路决定出路。。。
1楼 2013-11-25 22:38:40
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)
坐等解答  我也要做以后 学习了
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生命不息奋斗不止
2楼2013-11-26 00:04:20
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zzl2516

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lmcyjxs: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-11-26 18:55:22
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-27 12:37:45
你这扩增能曲线都没有到平台期肯定不行，建议提高模板和引物浓度，使扩增曲线打到平台期，让CT值提前一些，最好到10-20之间吧
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3楼2013-11-26 08:37:57
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bio-li

金虫 (小有名气)
这个图做标曲应该是不行的，而且标曲的点应该是5-7个
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你不能解决问题，你就会成为问题
4楼2013-11-26 10:11:20
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沙门小rna

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lmcyjxs: 金币+4, ★★★很有帮助 2013-11-26 18:59:04
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-27 12:37:52
要我说你发文章用的话不太赖斯了。5个点是起步价。当然。如果你的所有目的基因在4个点的范围内。那也就将就凑合能用来分析。还是那句话。5个点是起步价啊。专家估计不会认可的~当然你的扩增效率还蛮高的。然后ct也落在合适的区间。要是5个点就完美了~再多做一次吧如果有条件的话~
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应助之星就是我~没错。你没有看错~
5楼2013-11-26 11:07:58
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zzl2516 at 2013-11-26 08:37:57
你这扩增能曲线都没有到平台期肯定不行，建议提高模板和引物浓度，使扩增曲线打到平台期，让CT值提前一些，最好到10-20之间吧

是这样的，这个起始浓度已经是没有稀释的混合液了，5倍梯度稀释，有些基因表达量本来就很低，这样就不可能有完美的平台期，那请问还有什么方法可以改进呢？
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思路决定出路。。。
6楼2013-11-26 18:57:11
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 沙门小rna at 2013-11-26 11:07:58
要我说你发文章用的话不太赖斯了。5个点是起步价。当然。如果你的所有目的基因在4个点的范围内。那也就将就凑合能用来分析。还是那句话。5个点是起步价啊。专家估计不会认可的~当然你的扩增效率还蛮高的。然后ct也落 ...

我问了技术支持，技术支持说勉强能用，我的所有目的基因基本上可以落在4个点范围内，少数样品表达量很低的Cq都在30后了
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思路决定出路。。。
7楼2013-11-26 18:58:38
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沙门小rna

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-11-26 18:58:38
我问了技术支持，技术支持说勉强能用，我的所有目的基因基本上可以落在4个点范围内，少数样品表达量很低的Cq都在30后了...

好的。那你就用吧。如果投点分子生物学的国外期刊。那就难了
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应助之星就是我~没错。你没有看错~
8楼2013-11-26 19:21:46
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real-time

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-27 12:38:03
lmcyjxs: 回帖置顶 2013-12-05 08:49:21
引用回帖:
6楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-11-26 18:57:11
是这样的，这个起始浓度已经是没有稀释的混合液了，5倍梯度稀释，有些基因表达量本来就很低，这样就不可能有完美的平台期，那请问还有什么方法可以改进呢？...

你现在做标准曲线碰到的问题是你的样本浓度不够高
你的样品是什么，RAN DNA 或者 CDNA？
你的标准曲线是用什么做的？
如果后面要检测的样品是DNA，那可以做克隆，用线性化的质粒来做标准曲线和体系优化
如果后面要检测的样品的RNA（做一步法，就是逆转录和real time一起做的），那可以做体外转录，用体外转录RNA来做标准曲线和体系优化
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一步法逆转录RNA多重实时荧光定量PCR课题服务QQ461749807
9楼2013-11-27 08:37:46
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yangjianchen

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-27 12:38:11
只要样品的Ct值落在标曲范围内都应该是可以接收到哦，但是梯度尽量多肯定是更好的。我们之前做都是设置7个梯度，最后去掉一两个差的。
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10楼2013-11-27 11:12:32
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