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lmcyjxs

金虫 (正式写手)

[求助] 求教,荧光定量PCR标曲问题

本人做标曲做了5个点,但是总是有一个点没做好,剔除那个点后,线性还算好,扩增效率90%~110%之间,引物特异性是考察过的,有稍微的引物峰,但未超过阈值,因为做过几次了,还是这样,且做实验试剂耗材已用完,仪器使用需收费,想了解下,4个点虽然不严谨,但可否接受呢?在此附上图片,请大侠分析,谢谢啦!
求教,荧光定量PCR标曲问题
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求教,荧光定量PCR标曲问题-1
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思路决定出路。。。
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real-time

至尊木虫 (著名写手)

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-27 12:38:03
lmcyjxs: 回帖置顶 2013-12-05 08:49:21
引用回帖:
6楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-11-26 18:57:11
是这样的,这个起始浓度已经是没有稀释的混合液了,5倍梯度稀释,有些基因表达量本来就很低,这样就不可能有完美的平台期,那请问还有什么方法可以改进呢?...

你现在做标准曲线碰到的问题是你的样本浓度不够高
你的样品是什么,RAN DNA 或者 CDNA?
你的标准曲线是用什么做的?
如果后面要检测的样品是DNA,那可以做克隆,用线性化的质粒来做标准曲线和体系优化
如果后面要检测的样品的RNA(做一步法,就是逆转录和real time一起做的),那可以做体外转录,用体外转录RNA来做标准曲线和体系优化
一步法逆转录RNA多重实时荧光定量PCR课题服务QQ461749807
9楼2013-11-27 08:37:46
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real-time

至尊木虫 (著名写手)

引用回帖:
11楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-12-05 08:48:10
1 样本浓度的确不高,主要是样品提取的RNA产量太低,样品是木本植物提取的RNA,不好提取,标曲采用混合cDNA为模板做的,
2 我也知道可以做克隆,用质粒来做标曲,但是有点麻烦,本实验室条件较不方便。。。
     ...

如果样本浓度不高,又不想做克隆,那就用PCR产物来做咯,PCR产物做个梯度稀释
但是一定要注意预防污染,最好把PCR产物拿到别的实验室(远点)开盖稀释
稀释后带回实验室做后面的
一步法逆转录RNA多重实时荧光定量PCR课题服务QQ461749807
16楼2013-12-05 11:36:55
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