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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求教，荧光定量PCR标曲问题
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)

[求助] 求教，荧光定量PCR标曲问题

本人做标曲做了5个点，但是总是有一个点没做好，剔除那个点后，线性还算好，扩增效率90%~110%之间，引物特异性是考察过的，有稍微的引物峰，但未超过阈值，因为做过几次了，还是这样，且做实验试剂耗材已用完，仪器使用需收费，想了解下，4个点虽然不严谨，但可否接受呢？在此附上图片，请大侠分析，谢谢啦！
求教，荧光定量PCR标曲问题
1.jpg


求教，荧光定量PCR标曲问题-1
2.jpg
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思路决定出路。。。
1楼 2013-11-25 22:38:40
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real-time

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-12-05 08:48:10
1 样本浓度的确不高，主要是样品提取的RNA产量太低，样品是木本植物提取的RNA，不好提取，标曲采用混合cDNA为模板做的，
2 我也知道可以做克隆，用质粒来做标曲，但是有点麻烦，本实验室条件较不方便。。。
     ...

如果样本浓度不高，又不想做克隆，那就用PCR产物来做咯，PCR产物做个梯度稀释
但是一定要注意预防污染，最好把PCR产物拿到别的实验室（远点）开盖稀释
稀释后带回实验室做后面的
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一步法逆转录RNA多重实时荧光定量PCR课题服务QQ461749807
16楼2013-12-05 11:36:55
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)
坐等解答  我也要做以后 学习了
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生命不息奋斗不止
2楼2013-11-26 00:04:20
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zzl2516

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lmcyjxs: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-11-26 18:55:22
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-27 12:37:45
你这扩增能曲线都没有到平台期肯定不行，建议提高模板和引物浓度，使扩增曲线打到平台期，让CT值提前一些，最好到10-20之间吧
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3楼2013-11-26 08:37:57
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bio-li

金虫 (小有名气)
这个图做标曲应该是不行的，而且标曲的点应该是5-7个
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你不能解决问题，你就会成为问题
4楼2013-11-26 10:11:20
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