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anna87

新虫 (初入文坛)

[求助] 表达载体的选择及连接 已有1人参与

目的基因连到PMD18-T。转化DH5α，挑菌斑摇菌测序正确，再怎么连到表达载体上   需要准备什么  谢谢
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1楼 2013-11-25 14:50:36
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 鼓励发贴积极交流。 2013-11-25 18:09:42
你是真核表达，还是原核表达

你是动物还是植物？

你连pMD18-T时，基因两头带酶切位点了吗？如果带了直接酶切基因及载体，然后连接，如果没有，就重新设计带酶切位点的引物，PCR后再酶切做连接
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-11-25 15:28:09
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zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
注意起始密码子和终止密码子，是否有tag等等
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3楼2013-11-25 18:26:39
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doglet

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-12-12 15:35:30
如果原核表达，注意读码框，一定要对准，后面不用考虑终止密码子，一般的原核表达载体上都有终止密码子，特别是带有标签的载体，一定要注意读码框。真核表达载体插入片段一定要有ATG和终止密码子
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4楼2013-11-25 20:41:34
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-12-12 15:35:35
如果要做表达，目的基因如果是PCR获得，先要测序，序列正确后可以做进一步克隆。根据你要做表达的体系考虑是否有稀有密码子。如果有，需要替换才能高效表达。一般在设计基因表达时，在第一步PCR设计引物时就要考虑连到什么表达载体里，选择合适的酶切位点克隆。因为做一次PCR，就可能有碱基错配的可能，尽量避免反复PCR来获取基因。
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5楼2013-11-26 08:48:06
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呀薯条

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-12-12 15:35:39
我也正在做表达，不过是原核基因的表达，还在学习中，不过有看到说是要是有加酶切位点的话，要先检测下，你的目的基因中是否会有该酶切位点，没有最好，不然会影响最后的结果
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6楼2013-12-12 09:16:46
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