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gyesang

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[交流] Western Blot电泳时浓缩胶漏样 解决方法 已有8人参与

Western Blot电泳时浓缩胶漏样 解决方法


最近一直在做WB,发现有时候样品会从浓缩胶孔中渗漏出来,如果漏的不严重的话,不太会影响实验结果,如果漏的严重的话,那么整个实验就会因为蛋白电泳时漏样而功亏一篑,然而这种蛋白样品漏样问题却是普遍存在的,以下是本论坛里面曾经求助过的帖子,都比较典型:
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3064587&fpage=1
Western Blot电泳时浓缩胶漏样 解决方法

http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3204551&fpage=1
Western Blot电泳时浓缩胶漏样 解决方法-1

http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4560919&fpage=1
Western Blot电泳时浓缩胶漏样 解决方法-2

http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6438403&fpage=1
Western Blot电泳时浓缩胶漏样 解决方法-3

http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6515753&fpage=1
Western Blot电泳时浓缩胶漏样 解决方法-4

曾经也为样品漏样问题而苦恼,于是就开始翻阅各种论坛,试图从其他网友那里获取解决这个问题的经验,经过一段时间查阅,综合各网友意见及与身边同学讨论,基本得出一个可行的解决方案,供遇到同样问题的网友参考。

关于漏胶的原因,综合各网友意见,总结起来有以下几点:
1. 试剂原因,如丙烯酰胺不纯等
2. 玻璃板不干净,不干净的玻璃板在胶与玻璃贴合的过程中会产生缝隙
3. 梳子和胶板不配套,先卸胶板后拔梳子,梳子将胶板挤开
4. 制胶架没加紧导致玻璃板与胶之间有空隙
5.  压分离胶的液体去除不干净,导致浓缩胶没粘在玻璃板上
6. 上样时操作有问题,加样时枪头插入过深导致胶与玻璃板之间剥离
7.  浓缩胶有点干,胶收缩了,脱离玻璃板
8. 其他操作造成玻璃板之间有微小的错动
9. 玻璃需要处理,比如用玻璃硅化的试剂,把旧玻璃板硅化一下



无一例外,一般漏胶均出现在浓缩胶部分,分离胶很少出现漏样的现象
究其本质原因,就是浓缩胶没有与玻璃板粘紧

排除因操作因素导致胶板错动外,增加胶与玻璃板的粘合度可以尝试以下几点:
1. 玻璃板清洗干净
2. 在灌浓缩胶之前,尝试把分离胶上和玻璃板间的水吸干,然后先取少量浓缩胶液(含APS和TEMED)灌进胶板润洗,即迅速轻轻左右晃几下,让玻璃板充分沾上浓缩胶液,再把这些胶液去掉,然后再正式灌满浓缩胶,插进梳齿。
3. 延长浓缩胶凝固时间(>30min),配胶后可放冰箱(注意保湿),第二天用小一点的电压跑上层胶,可以减少漏胶的几率
4. 拔梳子的时候要小心,不要扯动胶


谨以此帖与大家一起学习交流,希望能对大家WB跑胶漏样问题有所改善!

欢迎积极反馈!


[ Last edited by gyesang on 2013-11-8 at 16:23 ]
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gyesang

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引用回帖:
4楼: Originally posted by 笨熊zhou at 2013-11-10 20:18:26
楼主你好,是不是做的胶浓度太低了,增加浓度试试

浓缩胶的浓度一般都是固定的,5%,不知道你用的是多大浓度的?
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
5楼2013-11-10 22:57:03
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查看全部 10 个回答

Lovebirdshs

木虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
感觉应该是玻璃板没有刷干净或者分离胶未完全凝固,根据本人经验一般都是基层胶最边上1到2个泳道会有边际效应造成胶图不规则,分离胶出问题一般都是带型模糊杂乱。
孤独的舞者
3楼2013-11-10 19:47:16
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笨熊zhou

木虫 (小有名气)

楼主你好,是不是做的胶浓度太低了,增加浓度试试
每天对着镜子开心一笑
4楼2013-11-10 20:18:26
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赞!!!!!

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
6楼2013-11-18 19:54:25
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