应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 镍柱亲和层析纯化
71/1返回列表
查看: 6734  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

gengpy470

新虫 (小有名气)

[求助] 镍柱亲和层析纯化

求助各位高手，我做的是真核细胞内纯化his标签蛋白，做镍柱亲和层析时在流穿的部分也检测到目的蛋白了，我的裂解液里含10mM咪唑，请大家帮我分析一下原因
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

蛋白质生物学实验经验 结构生物学

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-11-08 10:20:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-18 17:25:26
10mM咪唑就将目的蛋白洗脱了？
有可能真核蛋白各种修饰和折叠较多，将his标签包埋在内部了。
赞一下 回复此楼
Thank-you，so-blue.
2楼2013-11-08 15:16:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gengpy470

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by susizheng at 2013-11-08 15:16:56
10mM咪唑就将目的蛋白洗脱了？
有可能真核蛋白各种修饰和折叠较多，将his标签包埋在内部了。

那我要是加变性剂脲的话，在裂解液，漂洗液，和洗脱液里都需要加吗，我认为在洗脱液里不需要加了吧
赞一下 回复此楼
3楼2013-11-08 16:39:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
不用吧，只需要在变性的时候加变形剂吧。
赞一下 回复此楼
Thank-you，so-blue.
4楼2013-11-08 17:13:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+5, 丽丽好人！ 2013-11-18 17:25:55
楼主的问题就是带组氨酸X6标签的蛋白质挂上镍柱能力差的问题，我提示几点：
1.目的蛋白质如果在表达过程中一直处于溶解状态的，在非变性条件下也能够和Ni-NTA柱上得到纯化。如果形成了包涵体过着其他不溶性沉淀，可在6mol/L的盐酸胍或者8mol/LUrea中溶解后上镍柱。对于分泌蛋白质一般采用非变性条件纯化。变性过程可以用表面活性剂。
2.纯化时可采用变性条件和非变性条件，取决于目标蛋白质的溶解度和（His）6是否能够暴露在蛋白质的分子表面。如果在变性条件或者非变性条件下之一不挂柱，可改换位另一条件，并且改用别的变性剂或者表面活性剂。
大于1mmol/L的DTT会还原镍离子而无法挂柱。
3.如果溶液中存在较高浓度的螯合剂（EDTA/ETGA等）、离子型去污剂、甘氨酸、组胺、含有NH4+离子的试剂等，都会使得目的蛋白质无法挂上镍柱。
4.蛋白质形成了多聚体、或者与DNA相互作用遮蔽了（His）6位点也会使得目的蛋白质无法挂上镍柱。
5.目的蛋白质折叠时形成了遮蔽了（His）6位点会使得目的蛋白质无法挂上镍柱，构建基因时（His）6可以在N末端也可以在C末端，但是要处于蛋白质的分子表面，而且要与蛋白质分子之间最好有一段亲水序列，最好能够引入酶切位点（比如凝血酶酶切位点）。
6.可能在楼主的实验条件下，被纯化的蛋白质发生了聚合，也就是遮盖了至少一些蛋白质分子上的组氨酸X6标签的，洗脱时实际上先被洗下来的不是结合在镍柱上靠组氨酸X6标签与镍离子形成配位键的目的蛋白质，而是结合在镍柱上靠组氨酸X6标签与镍离子形成配位键的目的蛋白质以非共价建附着的目的蛋白质。
赞一下(3人) 回复此楼
5楼2013-11-09 02:29:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

haodanfeng

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-18 17:25:45
1、可以在样品中添加适量的尿素
2、建议样品浓缩之后再上样
赞一下 回复此楼
6楼2013-11-18 16:42:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

swani

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

如果是包涵体的话，那么上柱的样品应该是很混的，而且上柱前lz肯定是离心过的，包涵体比重大很容易去除，所以lz的情况肯定不是因为目的蛋白形成了包涵体的原因。

镍柱的柱容量不大，而且特异性不是我们想象的那么好，真核细胞破碎后含有的蛋白种类太多，lz的情况极有可能是蛋白过载而流穿，建议减少上样量或者加大柱体积，或者换种填料先做一次初纯化。当然，希望lz的镍柱本身是没有问题的。
赞一下 回复此楼
7楼2013-11-19 05:23:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 gengpy470 的主题更新
71/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 Aj1rhIDL5ixY 2026-09-14 3/150 2026-09-15 19:59 by CgyNCDVNhGVg
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 6F5UbRU2I5hL 2026-09-14 3/150 2026-09-15 17:39 by CgyNCDVNhGVg
[考研] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 6F5UbRU2I5hL 2026-09-14 4/200 2026-09-15 17:23 by CgyNCDVNhGVg
[博后之家] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 s3fFTmArrBt6 2026-09-14 5/250 2026-09-15 16:50 by CgyNCDVNhGVg
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +6 s3fFTmArrBt6 2026-09-14 7/350 2026-09-15 16:47 by CgyNCDVNhGVg
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +5 s3fFTmArrBt6 2026-09-14 5/250 2026-09-15 16:35 by CgyNCDVNhGVg
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 s3fFTmArrBt6 2026-09-13 3/150 2026-09-15 15:50 by CgyNCDVNhGVg
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +4 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 5/250 2026-09-15 14:58 by CgyNCDVNhGVg
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +6 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 6/300 2026-09-15 14:38 by VMDqgnlKimtZ
[硕博家园] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 4/200 2026-09-15 14:34 by VMDqgnlKimtZ
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +6 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 7/350 2026-09-15 14:13 by VMDqgnlKimtZ
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +5 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 5/250 2026-09-15 14:02 by VMDqgnlKimtZ
[公派出国] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 6F5UbRU2I5hL 2026-09-14 3/150 2026-09-15 08:58 by C79jjtjAKjEn
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +4 6F5UbRU2I5hL 2026-09-14 4/200 2026-09-15 08:02 by C79jjtjAKjEn
[教师之家] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +4 s3fFTmArrBt6 2026-09-13 4/200 2026-09-15 07:02 by 5BDX0d0WFp7t
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 s3fFTmArrBt6 2026-09-13 5/250 2026-09-15 06:49 by 5BDX0d0WFp7t
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +6 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 6/300 2026-09-15 05:50 by 5BDX0d0WFp7t
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +6 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 6/300 2026-09-15 05:38 by 5BDX0d0WFp7t
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +6 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 7/350 2026-09-15 05:22 by 5BDX0d0WFp7t
[基金申请] 求教各位大神：2026教育部人文社科青年基金项目何时公示呀？ +5 云宴山人 2026-09-10 7/350 2026-09-14 12:11 by ecnu2013
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭