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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 镍柱亲和层析纯化
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gengpy470

新虫 (小有名气)

[求助] 镍柱亲和层析纯化

求助各位高手，我做的是真核细胞内纯化his标签蛋白，做镍柱亲和层析时在流穿的部分也检测到目的蛋白了，我的裂解液里含10mM咪唑，请大家帮我分析一下原因
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1楼 2013-11-08 10:20:33
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+5, 丽丽好人！ 2013-11-18 17:25:55
楼主的问题就是带组氨酸X6标签的蛋白质挂上镍柱能力差的问题，我提示几点：
1.目的蛋白质如果在表达过程中一直处于溶解状态的，在非变性条件下也能够和Ni-NTA柱上得到纯化。如果形成了包涵体过着其他不溶性沉淀，可在6mol/L的盐酸胍或者8mol/LUrea中溶解后上镍柱。对于分泌蛋白质一般采用非变性条件纯化。变性过程可以用表面活性剂。
2.纯化时可采用变性条件和非变性条件，取决于目标蛋白质的溶解度和（His）6是否能够暴露在蛋白质的分子表面。如果在变性条件或者非变性条件下之一不挂柱，可改换位另一条件，并且改用别的变性剂或者表面活性剂。
大于1mmol/L的DTT会还原镍离子而无法挂柱。
3.如果溶液中存在较高浓度的螯合剂（EDTA/ETGA等）、离子型去污剂、甘氨酸、组胺、含有NH4+离子的试剂等，都会使得目的蛋白质无法挂上镍柱。
4.蛋白质形成了多聚体、或者与DNA相互作用遮蔽了（His）6位点也会使得目的蛋白质无法挂上镍柱。
5.目的蛋白质折叠时形成了遮蔽了（His）6位点会使得目的蛋白质无法挂上镍柱，构建基因时（His）6可以在N末端也可以在C末端，但是要处于蛋白质的分子表面，而且要与蛋白质分子之间最好有一段亲水序列，最好能够引入酶切位点（比如凝血酶酶切位点）。
6.可能在楼主的实验条件下，被纯化的蛋白质发生了聚合，也就是遮盖了至少一些蛋白质分子上的组氨酸X6标签的，洗脱时实际上先被洗下来的不是结合在镍柱上靠组氨酸X6标签与镍离子形成配位键的目的蛋白质，而是结合在镍柱上靠组氨酸X6标签与镍离子形成配位键的目的蛋白质以非共价建附着的目的蛋白质。
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5楼2013-11-09 02:29:23
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-18 17:25:26
10mM咪唑就将目的蛋白洗脱了？
有可能真核蛋白各种修饰和折叠较多，将his标签包埋在内部了。
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Thank-you，so-blue.
2楼2013-11-08 15:16:56
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gengpy470

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by susizheng at 2013-11-08 15:16:56
10mM咪唑就将目的蛋白洗脱了？
有可能真核蛋白各种修饰和折叠较多，将his标签包埋在内部了。

那我要是加变性剂脲的话，在裂解液，漂洗液，和洗脱液里都需要加吗，我认为在洗脱液里不需要加了吧
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3楼2013-11-08 16:39:15
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
不用吧，只需要在变性的时候加变形剂吧。
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Thank-you，so-blue.
4楼2013-11-08 17:13:23
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